ZntR：调控鸭疫里默氏杆菌锌稳态与致病性的关键因子

本文聚焦鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer），发现 ZntR 作为锌稳态（zinc homeostasis）的关键调节因子，可通过影响锌转运蛋白 ZupT 等基因表达，调控菌体内锌平衡，且与细菌的氧化应激反应、致病性相关，为深入了解该菌致病机制提供新视角。

　　

引言

锌（Zn²⁺）在生物体内至关重要，参与 DNA 复制、转录调控等关键生化过程。在细菌与宿主的 “博弈” 中，宿主会限制锌的供应以抑制细菌生长，如中性粒细胞分泌的钙卫蛋白可螯合锌，巨噬细胞中的 Zn²⁺转运蛋白 ZIP8 能降低溶酶体 Zn²⁺浓度抑制细菌。而细菌进化出多种锌摄取系统，如革兰氏阴性菌通过非特异性孔蛋白或 TonB 依赖受体摄取锌，在锌缺乏时，Salmonella typhimurium等细菌的 ZnuABC 系统会将锌从周质转运到细胞质；锌充足时，部分细菌会表达低亲和力锌转运蛋白 ZupT。不过，过量的锌对细菌有毒性，会导致蛋白质功能异常，影响细菌的多种生理过程，如锰摄取、氧化应激抗性、碳代谢等。为应对锌毒性，细菌拥有锌外排机制，像Vibrio parahaemolyticus的 P 型 ATP 酶 ZntA、Acinetobacter baumannii的 RND 系统 CzcCBA 等。

细菌通过转录调节因子感知细胞质中锌水平的变化，从而调控锌摄取蛋白和锌外排蛋白的表达，维持锌稳态。常见的转录调节因子有Yersinia pseudotuberculosis的 Zur、Streptococcus suis的 AdcR 等，ZntR 作为 MerR 家族成员，在不同细菌中发挥着不同的调控作用。

鸭疫里默氏杆菌是革兰氏阴性菌，能引起鸭和其他水禽感染，导致败血症和感染性浆膜炎，且具有多种血清型，对多种抗生素耐药，其锌稳态相关基因此前尚未被研究。本研究旨在探索鸭疫里默氏杆菌 CH-1 菌株中与锌稳态相关的基因，为深入了解其致病机制奠定基础。

材料与方法

1. 实验材料准备：明确实验所用的细菌菌株、质粒、引物、生长培养基和抗生素。E. coli在 LB 培养基培养，鸭疫里默氏杆菌在羊血平板或 TSB 培养基培养，根据实验需求添加相应抗生素。
2. 菌株构建：通过重叠 PCR 构建zntR基因缺失菌株和zupT基因缺失菌株，并利用自然转化法将构建好的片段导入鸭疫里默氏杆菌 CH-1 菌株，筛选得到重组突变菌株。同时，将zntR和zupT编码序列克隆到 pLMF02 质粒，通过接合转移构建互补菌株。
3. 实验方法：进行生长曲线测定，观察不同菌株在添加或不添加 ZnSO₄的 TSB 培养基中的生长情况。采用纸片扩散法检测菌株对不同金属离子（MnCl₂、ZnSO₄、CuCl₂、CoCl₂、NiCl₂）的敏感性。利用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）测定菌株细胞内的金属含量。通过氧化应激敏感性试验，检测菌株对 H₂O₂和 NaOCl 的敏感性。进行毒力和定植试验，观察菌株对雏鸭的致死率以及在雏鸭组织中的定植情况。运用转录组分析和蛋白质组分析，研究基因和蛋白质表达水平的变化，同时通过 qRT-PCR 验证转录组数据，用斑点试验研究zupT基因功能。
4. 数据分析：使用 Majorbio Cloud Platform 和 OmicShare tool 进行蛋白质组和转录组分析，利用 GraphPad Prism 8 进行数据处理和统计分析，通过特定检验判断数据的显著性差异。

结果

1. ZntR 影响锌稳态：鸭疫里默氏杆菌 CH-1 菌株的B739_RS08595基因编码的蛋白与多种细菌的 ZntR 有一定同源性，将其命名为zntR。zntR缺失菌株在含锌培养基中生长受抑制，对 ZnSO₄敏感性增加，且细胞内锌含量显著升高，而对其他金属离子的敏感性和含量无明显变化，表明 ZntR 在维持锌稳态中起关键作用。
2. ZntR 与氧化应激反应相关：zntR缺失菌株对 H₂O₂和 NaOCl 的抗性增强，说明 ZntR 参与鸭疫里默氏杆菌的氧化应激反应。
3. ZntR 对转录组和蛋白质组的影响：转录组测序显示，zntR缺失菌株与野生型相比，有 291 个基因上调，198 个基因下调，涉及金属转运、锌结合等功能。蛋白质组分析表明，zntR缺失菌株有 204 个蛋白上调，163 个蛋白下调，功能也与金属转运和锌结合相关。综合分析发现，转录组和蛋白质组中有部分基因和蛋白的表达变化一致，体现了转录后或翻译后的复杂调控。
4. ZupT 的功能：转录组数据显示B739_RS07625（后命名为zupT）在zntR缺失菌株中上调，经 qRT-PCR 验证，ZntR 抑制其转录。构建zupT缺失菌株和互补菌株研究发现，ZupT 参与锌摄取，且缺失zupT会降低菌株对氧化应激的抗性。
5. ZntR 影响致病性：毒力和定植试验表明，zntR缺失菌株对雏鸭的致死率降低，在雏鸭心脏、肝脏、脾脏和大脑等组织中的定植能力减弱，说明 ZntR 对鸭疫里默氏杆菌在雏鸭体内的定植至关重要。

讨论

锌对细菌生存必不可少，细菌通过多种机制维持锌稳态。本研究证实鸭疫里默氏杆菌的 ZntR 参与锌稳态调节，且 ZntR 对细菌生长的影响与其他细菌不同，可能与细胞内锌含量升高及代谢途径紊乱有关。研究还发现，T9SS、TonB 依赖受体和 RND 系统可能参与鸭疫里默氏杆菌的锌稳态调节。ZupT 在鸭疫里默氏杆菌生长中起重要作用，与其他细菌有所差异。zntR缺失菌株对氧化应激耐受性增加，可能与细胞内锌含量、zupT上调和过氧化氢酶 KatE 上调有关。此外，ZntR 影响鸭疫里默氏杆菌在雏鸭体内的定植能力，对其致病性有重要影响。本研究为理解鸭疫里默氏杆菌在锌限制和过量环境中的锌稳态机制提供了重要依据，有助于深入研究该菌的致病机制，为防控鸭疫里默氏杆菌感染提供新的思路和方向。