碳青霉烯耐药摩根氏菌的全球追踪：基因传播与进化特征解析

本文通过监测和基因组分析，揭示碳青霉烯耐药摩根氏菌（CRMM）的遗传特性与传播机制。

　　

碳青霉烯耐药摩根氏菌研究背景

摩根氏菌属（Morganella spp.）隶属于肠杆菌目（Enterobacterales）摩根氏菌科（Morganellaceae），包含 6 个物种，其中摩根摩根氏菌（M. morganii）在人类、动物和环境中广泛分布，已成为全球医院获得性感染的高风险病原体。它引发的尿路感染发病率较高，且在血流感染患者中死亡率尤为突出。

碳青霉烯耐药摩根氏菌（CRMM）作为碳青霉烯耐药肠杆菌科的一部分，被世界卫生组织列为关键优先病原体，给临床治疗带来极大挑战。CRMM 的频繁出现主要归因于 bla_KPC-2和 bla_NDM-1等耐药基因的传播，多种质粒在这些耐药基因于摩根氏菌中的扩散以及不同物种间的水平转移中发挥着重要作用。然而，目前全球范围内对 CRMM 的系统地理分布和遗传特征研究仍较为匮乏。

碳青霉烯耐药摩根氏菌研究成果

碳青霉烯耐药摩根氏菌菌株特征

2016 年 1 月至 2022 年 12 月，研究人员从中国杭州一家三级医院分离出 19 株 CRMM 菌株。经筛选和验证，获得 6 株含有 bla_KPC或 bla_NDM的菌株作进一步研究。这些菌株源自 5 名 55 - 89 岁患者的痰液和尿液样本。

抗菌药敏试验（AST）显示，这 6 株 CRMM 菌株对美罗培南（MEM）、亚胺培南（IPM）、厄他培南（ETP）、头孢吡肟（FEP）、环丙沙星（CIP）和头孢他啶（CAZ）均耐药，但对头孢地尔（CFDC）敏感。部分菌株对阿米卡星（AMK）和头孢他啶 - 阿维巴坦（CZA）也存在耐药情况。研究还鉴定出携带 bla_KPC-2的 3 种质粒（IncN、IncL/M 和 IncFII-R）以及携带 bla_NDM-1的 2 种质粒（IncFII-FIB 和一种未知质粒），除 IncFII-FIB 外，其余质粒均成功共轭转移至大肠杆菌 J53。

携带 bla_KPC-2或 bla_NDM-1质粒的稳定性和适应性影响

与大肠杆菌 J53 相比，携带 bla_KPC-2或 bla_NDM-1的转接合子在生长曲线、曲线下面积（AUC）和相对生长率等方面均显著降低，表明这些质粒介导的耐药基因表达对细菌适应性存在负面影响。部分质粒在无抗生素环境下稳定性较差，如大质粒 pMM9291-NDM-1_257k 在第五代时完全丢失，而部分质粒（如 pMM4512-KPC-2_142k）在后代中出现部分丢失。

携带 bla_KPC-2或 bla_NDM-1的 CRMM 菌株基因组特征

6 株 CRMM 分离株均含有一条约 4 Mb 的染色体和 1 - 3 个质粒。全基因组测序（WGS）显示，携带 bla_KPC-2的 4 株分离株拥有 22 个耐药基因（ARGs），可对 7 类抗菌药物产生耐药性；携带 bla_NDM-1的 2 株分离株则含有 18 个 ARGs，能对 6 类抗菌药物耐药。

通过对 ICU 中分离的菌株分析，发现 IncL/M 质粒可能通过 IS₂₆介导的移动元件获得 bla_KPC-2，相关菌株在单核苷酸多态性（SNP）上高度同源，且质粒序列相似。

bla_KPC和 bla_NDM在摩根氏菌中传播的相关事件

对 bla_KPC-2核心遗传区域分析发现，基于 Tn₆₂₉₆的完整性，存在 5 组 Tn₆₂₉₆衍生物，遗传结构 IS₂₆-bla_KPC-2-IS₂₆在 bla_KPC-2传播中较为普遍，此外还发现了不同的背景结构。

针对 bla_NDM核心遗传环境分析显示，其传播可分为 5 种紧密相关的 Tn₁₂₅衍生物，上下游区域存在由 IS₂₆、IS_CR元件和 Tn₃家族插入序列介导的显著变异，部分 bla_NDM变体可整合到染色体中。

产 KPC 或 NDM 摩根氏菌的全球监测

研究人员从本研究和 GenBank 获取 968 个非重复摩根氏菌属基因组，经 ARG 筛选得到 190 株携带 bla_KPC或 bla_NDM的碳青霉烯耐药摩根氏菌（CRMs），分布于 3 个物种。这些菌株携带 5 种碳青霉烯酶变体，其中 NDM-1 最为常见。

从全球分布来看，相关分离株来自五大洲 19 个国家，法国的分离株数量最多。NDM-1 产生的 CRMs 在五大洲分布最广，KPC-3 产生的 CRMs 仅在北美检测到，且过去十年中 bla_KPC-2和 bla_NDM-1的流行呈反向关系，近年来 bla_KPC-2出现增多趋势。

产 KPC 或 NDM 摩根氏菌的系统发育分析

对 190 株 CRMs 的核心基因组分析发现大量 SNP，不同物种间 SNP 数量差异明显，部分菌株间 SNP 较少，提示可能存在克隆传播。

构建的系统发育树显示，摩根摩根氏菌和西本摩根氏菌（M. sibonii）最早分化并独立聚类，钱氏摩根氏菌（M. chanii）在摩根摩根氏菌内进化。摩根摩根氏菌携带 bla_KPC或 bla_NDM的种群较大，具有高度克隆结构，分为 7 个系统发育群，不同群的分布存在区域特异性，且 IncR 质粒与 bla_KPC-2在部分群中存在显著相关性。

碳青霉烯耐药摩根氏菌研究讨论

研究中 986 株摩根氏菌属分离株分为 6 个物种，部分物种仅存在于动物和食品中，bla_KPC和 bla_NDM基因仅存在于 3 个常见物种中，表明耐药基因的传播可能使部分物种成为 “流行” 克隆，但具体内在机制尚待进一步研究。

CRMM 分离株对临床常用抗生素耐药，AST 结果显示 CZA 对产 KPC 的 CRMM 分离株有效，但对产 NDM 的菌株无效，CFDC 对 CRMM 具有体外抗菌活性，有望成为新的治疗选择。

WGS 发现 CRMM 菌株中广泛存在 ARGs，质粒多样性是 ARGs 传播的主要原因，多数携带耐药基因的质粒可稳定存在，增加了 CRMM 演变为 “超级细菌” 的风险。转座子在细菌进化和耐药基因传播中也起着关键作用，如 Tn₆₂₉₆对 bla_KPC的传播至关重要，IS₂₆参与其中；Tn₁₂₅在早期 bla_NDM传播中发挥重要作用，近年来被其他元件取代，IS_CR元件在 bla_NDM后期传播中意义重大。

通过地理分布分析发现欧洲是携带 bla_KPC或 bla_NDM的 CRMs 出现最多的大陆，但部分国家测序资源存在偏差，缺乏对一些中低收入国家流行病学趋势的评估。CRMM 存在克隆传播现象，因此有必要建立医院感染监测项目，预防高风险流行克隆的出现。

碳青霉烯耐药摩根氏菌研究结论

本研究通过 7 年的监测和基因组分析，揭示了产 KPC 或 NDM 的 CRMM 分离株的遗传特征和传播动态。确定了 Tn₆₂₉₆和 Tn₁₂₅等移动遗传元件在耐药基因水平转移中的作用，全球基因组流行病学研究阐明了摩根氏菌属的时空分布和进化轨迹。鉴于这些 “流行” 克隆的威胁不断升级，临床环境中加强监测和实施有效控制措施势在必行。

碳青霉烯耐药摩根氏菌研究方法

临床分离和耐药基因筛选

2016 年至 2022 年，研究人员从中国杭州一家三级医院收集经临床检测确定为碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（CRE）的摩根摩根氏菌分离株，采用 MALDI - TOF MS 进行菌株鉴定，通过胶体金免疫层析、聚合酶链反应（PCR）和 Sanger 测序筛选和验证碳青霉烯耐药基因（bla_KPC和 bla_NDM），分离株保存于 - 80°C 甘油肉汤中备用。

抗菌药敏试验

采用肉汤微量稀释法，使用阳离子调整的 Mueller - Hinton 肉汤（CAMHB）对 9 种抗菌药物进行 AST，头孢地尔使用缺铁的 CAMHB 进行测试，测试条件和结果依据临床和实验室标准协会标准进行解释，以大肠杆菌 ATCC 25922 作为质量控制。

结合转移实验

以大肠杆菌 J53（Azi^R）作为受体菌进行结合转移试验，探究携带 bla_KPC-2或 bla_NDM-1质粒的可转移性。将供体菌和受体菌的单克隆菌落培养至对数生长期后混合，在含滤膜的 MH 平板上培养过夜，在含叠氮化钠和氨苄青霉素的 MH 琼脂上筛选转接合子，并通过 PCR、MALDI - TOF MS 和 MIC 结果进行确认。

稳定性试验和生长速率测定

通过在无抗生素环境下的传代实验评估转接合子中含 bla_KPC-2或 bla_NDM-1质粒的稳定性，利用生长速率测定评估转接合子的适应性成本。将转接合子培养过夜后稀释，在无抗生素的 LB 肉汤中培养，使用 Bioscreen C MBR 机器测量 OD₆₀₀曲线，用 R 脚本计算相对生长速率。

全基因组测序和基因组分析

采用 Illumina HiSeq 和 Nanopore MinION 平台进行 WGS，使用 Unicycler 0.4.8 进行基因组组装，RAST 进行注释，利用 ResFinder 和 PlasmidFinder 分别鉴定抗生素耐药基因和质粒类型，通过 BLAST 查找相似序列，使用 BLASTn 和相关软件进行序列比较和可视化。

摩根氏菌属的全球地理分布和系统发育分析

评估 GenBank 中所有可用的摩根氏菌属基因组，依据平均核苷酸同一性（ANI）>95% 确定物种，通过 ARG 分析获取携带 bla_KPC或 bla_NDM的 CRMs。利用相关代码获取分离株生物样本信息，使用 Roary 和 FastTree 构建系统发育树，通过 TBtools - II 绘制 SNP 热图，用 Adobe Illustrator 绘制全球地理分布图。

核苷酸序列登录号

6 株分离株（4 株 bla_KPC-2阳性和 2 株 bla_NDM-1阳性）的完整染色体和质粒序列已提交至 GenBank，登录号列于相关表格中。

碳青霉烯耐药摩根氏菌研究致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金、浙江省卫生健康委员会科研基金重大健康科技计划项目和浙江省研发计划的支持。