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本文通过长读测序技术揭示了小龙虾病原体 Candidatus Paracoxiella cheracis（Ca. P. cheracis）全基因组序列，证实其为科氏杆菌科新属。研究分析了其致病相关的 Dot/Icm 四型分泌系统（T4SS）及效应蛋白，对水产养殖疾病防控和该菌科研究意义重大。
引言
澳大利亚淡水红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）在商业养殖中面临传染病威胁。20 世纪 90 年代，从患病螯虾中分离出的类立克次氏体胞内细菌 TO - 98，被认为是导致养殖红螯螯虾大规模死亡的病原体，后被命名为 Candidatus Coxiella cheraxi。虽经多方面研究确认其属于科氏杆菌科（Coxiellaceae），但碎片化的基因组数据阻碍了对其与 Coxiella burnetii 关系的深入理解。
C. burnetii 是人类 Q 热的病原体，在反刍动物中广泛存在。科氏杆菌科所属的军团菌目（Legionellales）包含众多未培养的属，其中多数新发现的细菌与非脊椎动物宿主形成共生关系，但部分可能具有致病性。Dot/Icm 四型分泌系统（T4SS）对 C. burnetii 和 Legionella pneumophila 的胞内复制和致病至关重要，该系统能将效应蛋白输送到宿主细胞，调节细胞功能。不同病原体的 Dot/Icm 系统效应蛋白存在差异，对这些蛋白的研究有助于深入了解致病机制和细胞生物学调控策略。本研究通过测定 Candidatus C. cheraxi 的全基因组序列，揭示其与 C. burnetii 的关系，确认其为新属，并对其 Dot/Icm T4SS 及效应蛋白进行分析。
材料和方法
在 2019 年以色列从澳大利亚进口红螯螯虾后，采集患病虾肝胰腺样本。提取样本 DNA，分别使用牛津纳米孔技术（ONT）的 MinION 和 PromethION 进行两次测序。利用 Dorado 软件进行碱基识别和质量过滤，Kraken2 进行读段分类，Flye、MetaMDBG 等多种工具进行初始组装，最终用 Trycycler 整合多个组装结果，Bakta 1.9.1 进行注释。
采用基因组分类数据库工具包（GTDB - Tk）对基因组进行分类，通过比较分析推断 Ca. P. cheracis 在军团菌目中的系统发育位置。使用 abritAMR、Mob - typer、PADLOC 等工具分别检测抗菌药物耐药性（AMR）决定因素、质粒复制子和 mob 基因、噬菌体防御机制，用 Bastion4 和 T4Sepp 筛选 Dot/Icm 效应蛋白，SECRET4 鉴定 T4SS 组件。
培养 C. burnetii Nine Mile phase II（NMII）菌株 RSA439 和 HeLa CCL2 细胞。构建携带 Ca. P. cheracis CpeB 同源物（PcCpeB）的 C. burnetii 转位报告菌株，通过 BlaM 报告转位试验检测效应蛋白的转位情况。
结果
Ca. P. cheracis 基因组包含一条染色体（2,233,862 bp）和两个质粒（59,783 bp 和 34,021 bp）。GTDB - Tk 分类表明其代表科氏杆菌科新属，系统发育树显示它与其他水生环境来源的科氏杆菌科细菌相近，与 C. burnetii 和 Coxiella 样内共生体（C - LEs）较远。Kraken2 分类结果受数据库限制，存在误导性，但长读数据成功组装出基因组。基因组中未发现已知 AMR 机制和质粒相关复制子、mob 基因，鉴定出多种噬菌体防御系统和大量转座酶。
Dot/Icm 系统在 Ca. P. cheracis 基因组中被检测到，其整合位点和基因排列与 C. burnetii 部分相似，但存在差异，如部分基因的有无和方向不同。蛋白质相似性分析显示，Ca. P. cheracis 的 Dot/Icm 蛋白与 C. burnetii 的相似性在 52% - 86% 之间，高于 Legionella 和 Candidatus Rickettsiella viridis 相关蛋白的相似性，C - LEs 基因组中未检测到完整 T4SS。
Bastion4 和 T4SEpp 预测出 355 个潜在 Dot/Icm 底物，排除 IS 元件后有 238 个，其中 66 个与 NCBI 中蛋白序列无显著相似性。12 个预测效应蛋白与 C. burnetii 已知或潜在效应蛋白相似。BlaM 转位报告试验证实，Ca. P. cheracis 的 PcCpeB 可通过 C. burnetii 的 Dot/Icm 系统转位，尽管其与 C. burnetii CpeB 氨基酸序列同一性仅 29%，但特定区域具有较高保守性。
讨论
由于缺乏 Ca. P. cheracis 活体样本，对其研究主要依赖基因组分析。系统发育位置、平均核苷酸同一性（ANI）等证据支持其为科氏杆菌科新属，且与 C. burnetii 和 C - LEs 关系较远。Dot/Icm T4SS 在不同菌中的演化差异显著，其在 C - LEs 中的丢失可能与宿主适应性有关。
检测胞内病原体存在困难，Ca. P. cheracis 的高拷贝转座酶可作为潜在诊断靶点，类似 Bordetella pertussis 通过 PCR 扩增高拷贝插入序列进行诊断，有望用于小龙虾养殖场的监测。
Ca. P. cheracis 预测的 Dot/Icm 效应蛋白与 Legionella 物种不同，很少具有真核结构域，大量为新发现蛋白。12 个与 C. burnetii 相似的效应蛋白中，部分在 C. burnetii 胞内生存中起重要作用，对更多科氏杆菌科基因组测序有助于确定 “核心” 效应蛋白。利用 C. burnetii 作为替代宿主证明 PcCpeB 转位，为研究 Ca. P. cheracis 宿主 - 病原体相互作用提供了新策略。
Ca. P. cheracis 基因组揭示了潜在诊断靶点和致病策略，其编码的 Mip 蛋白与 C. burnetii Mip 相似，Mip 抑制剂可能对 Ca. P. cheracis 感染有干预作用。ONT 测序技术在重构该病原体基因组中发挥重要作用，可捕获质粒和处理大量 IS 元件，在未来疫情调查中具有广阔应用前景。
