揭秘梭菌新成员：五株梭菌（Clostridium）菌株基因组草图绘制及其意义

梭菌（Clostridium）属分类学复杂，部分物种基因组序列缺失。来自新加坡的研究人员对五株梭菌菌株开展基因组测序研究，获得了一株梭菌（Clostridium neuense）和四株暂定种（Candidatus Clostridium species）的基因组草图，有助于理解梭菌功能。

　　梭菌（Clostridium）属的分类学和系统学较为复杂且尚未完全明确。截至 2024 年 12 月，根据《原核生物名称命名法》，该属包含 162 个有效发表的物种，但并非所有物种都有可用的基因组序列，比如从湖泊沉积物中分离出的梭菌（Clostridium neuense），其模式菌株就缺乏基因组序列。基因组序列的可得性不仅能提高梭菌系统学的分辨率，还能为深入了解它们的生理学和代谢提供帮助。在本研究中，研究人员展示了五株梭菌菌株的基因组草图。
菌株 WILCCON 0112 和 WILCCON 0114 分别从 2019 年 11 月取自俄罗斯的油葵粕（提取油脂后的干燥颗粒状产品）和 2019 年 8 月取自中国的豆渣（大豆加工的副产品）中分离得到。菌株 WILCCON 0185、WILCCON 0202 和 WILCCON 0269 则是用无菌刮刀从新加坡裕廊湖花园炮弹树（Couroupita guianensis）下的表层土壤样本中分离出来的，采集地点的经纬度为北纬 1.3359°，东经 103.7262°。
对于菌株 WILCCON 0112 和 WILCCON 0114 的分离，研究人员将样品的一部分通过涡旋重悬，然后在磷酸盐缓冲液（NaCl 137 mM，KCl 2.7 mM，Na₂HPO₄ 10 mM，KH₂PO₄ 1.8 mM；pH 7.4）中进行 4 步 10 倍系列稀释。取每个稀释度的 100 μL 溶液涂抹在 MRS 琼脂平板（1.6% 琼脂）上，在缺氧条件（4% 氢气、5% 二氧化碳和 91% 氮气）下 37°C 孵育 48 小时。菌株 WILCCON 0185、WILCCON 0202 和 WILCCON 0269 的分离方法与之类似，只是分别使用 ATCC 207、TS 或 RCM 琼脂平板，并在 30°C 下孵育。所有菌株都在新鲜琼脂平板上进行了三轮纯化。
将单个菌落接种到 2 mL Eppendorf 管中的相应液体培养基中，在上述各自条件下静置培养。使用 Maxwell 16 FFS 核酸提取系统（Promega 公司）从细胞沉淀中提取核酸。利用 Illumina NovaSeq 6000 系统进行短读长双端测序（2×150 bp 读长；新加坡 NovogeneAIT 基因组学公司），并使用 NEBNext Ultra DNA 文库制备试剂盒构建 DNA 文库。利用 Trimmomatic 0.39 版本对生成的 10,231,748 - 11,875,844 条原始读数进行质量修剪（参数：ILLUMINACLIP:NovaSeq - adaptor - sequences.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36）。使用 SPAdes 3.15.5 版本对获得的 10,091,090 - 11,765,546 条清洁读数进行从头组装（参数：--careful --cov - cutoff auto；最小重叠群长度：200 bp）。使用 QUAST 5.0.2 版本评估所得基因组组装的基本统计信息，使用 CheckM 1.2.2 版本（模式：lineage_wf）评估完整性和污染情况，使用 PGAP 6.9 版本（默认参数）进行注释。
五株菌株基因组草图的详细组装统计信息和基因内容信息总结在表格中。通过整体基因组相关性指数和系统发育分析验证了这五株梭菌菌株的分类身份。基于 16S rRNA 基因序列相似性，菌株 WILCCON 0114 被归为梭菌（Clostridium neuense），但这一鉴定需在获得模式基因组后进一步确认。其余四株菌株被提议作为暂定种梭菌（Candidatus Clostridium species），即暂定种向日葵梭菌（Candidatus Clostridium helianthi，WILCCON 0112）、暂定种土壤层梭菌（Candidatus Clostridium stratigraminis，WILCCON 0185）、暂定种草根梭菌（Candidatus Clostridium radicumherbarum，WILCCON 0202）和暂定种隐匿梭菌（Candidatus Clostridium eludens，WILCCON 0269）。
本研究由新加坡丰益国际有限公司资助。样本采集得到了新加坡国家公园管理局（National Parks Board，NParks）的批准，许可证号为 NP_RP20 - 124/124a。