解析人类抑制素复合物原位结构，解锁线粒体奥秘

为探究人类抑制素（PHB）功能，研究人员解析其在线粒体内膜结构，发现独特结构及分布特征，为相关研究奠基。

　　在细胞的微观世界里，线粒体就像一座繁忙的 “能量工厂”，为细胞的各种生命活动提供能量。而线粒体的正常运作离不开众多蛋白质的协同作用，其中抑制素（prohibitins，PHB）家族蛋白备受关注。抑制素是一类高度保守的蛋白质，广泛参与线粒体应激信号传导、细胞周期进程、细胞凋亡、寿命调节等多种重要生理过程。然而，尽管它们在线粒体内膜（mitochondrial inner membrane，MIM）中的定位已基本明确，但关于其分子组织形式，科学界却一直存在诸多争议。比如，虽然有研究推测酵母中抑制素可形成由 12 - 20 个 PHB1/PHB2 异二聚体组成的大环状复合物，但在人体细胞中，抑制素是否也存在类似结构，以及这些结构在细胞内的精确位置和数量，都缺乏直接的实验证据。正是在这样的背景下，来自德国哥廷根马克斯?普朗克多学科科学研究所等机构的研究人员，开启了对人类抑制素复合物原位结构的探索之旅。他们的研究成果发表在《Nature Cell Biology》上，为深入理解抑制素的功能提供了重要线索。

研究人员运用了多种先进的技术方法来开展此项研究。其中，关键技术包括冷冻电镜断层扫描（cryo - electron tomography，cryo - ET），它能让研究人员在接近生理状态下观察蛋白质复合物的结构；亚断层平均（subtomogram averaging）技术，用于获取抑制素复合物高分辨率的三维结构信息；分子建模（molecular modelling）则借助 AlphaFold2 预测蛋白质结构，并将其融入实验数据，构建出抑制素复合物的分子模型；此外，还利用了定量蛋白质免疫印迹（quantitative western blotting）、免疫共沉淀、荧光漂白恢复（fluorescence recovery after photobleaching，FRAP）等技术，从不同角度对抑制素进行研究。实验样本主要来源于人类 U2OS 细胞、大鼠海马神经元和 COS - 7 细胞。

研究结果主要分为以下几个方面：

1. 抑制素的定位：研究人员通过基因编辑技术构建了表达融合蛋白的细胞系，发现过表达会导致融合蛋白定位异常，而在接近内源性表达水平时，PHB1 - DK 和 PHB2 - DK 融合蛋白均定位于线粒体。免疫共沉淀实验表明，标记的抑制素能与内源性未标记的 PHB1 和 PHB2 形成复合物。进一步的定量免疫金电镜实验显示，PHB1 和 PHB2 主要富集于线粒体的嵴膜（crista membrane，CM），其在 CM 中的浓度是内膜边界（inner boundary membrane，IBM）的三到五倍，且在 CM 中具有较低的流动性。
2. 抑制素的丰度：通过定量蛋白质免疫印迹，研究人员测定出每个 U2OS 细胞中平均约含有(3.38±0.23)×106个 PHB1 分子和(3.46±0.15)×106个 PHB2 分子。基于假设的 16 聚体环结构计算，每个 U2OS 细胞约有2.14×105个抑制素环，平均每个嵴上约有 15 个抑制素环，每个嵴面约有 7 或 8 个抑制素环，这些环覆盖约 0.7 - 1.4% 的嵴表面。
3. 抑制素复合物的结构：利用 cryo - ET 技术，研究人员在 MIM 中观察到众多凸状结构，其大小、定位和取向与预期的抑制素结构一致。在敲低 PHB1 或 PHB2 后，这些凸状结构数量显著减少，证实其为抑制素复合物。通过亚断层平均技术，研究人员获得了抑制素复合物的高分辨率三维结构，发现其呈钟形，嵌入脂质双层，由 11 个交替的 PHB1 和 PHB2 分子组成，整体高度为 84.0，顶部直径为 89.0，底部直径为 190.2，且在脂质双层上方有一个大的空腔。
4. 抑制素复合物的分子模型：研究人员基于 AlphaFold2 预测的结构和 cryo - EM 数据，构建了抑制素复合物的分子模型。该模型显示，PHB1 和 PHB2 通过 N 端跨膜结构域嵌入脂质双层，相邻 PHB C 端相互作用稳定钟形顶部，且模型得到了交联质谱（XL - MS）数据和分子动力学（MD）模拟的支持。

研究结论和讨论部分指出，人类抑制素复合物的整体钟形结构与细菌抑制素同源物 HflK/C 相似，这种结构可能是 SPFH 蛋白家族功能的核心结构原则。抑制素复合物在嵴上的高丰度及其与相对膜的紧密空间关系，暗示其在 CM 的大规模空间组织中可能发挥着意想不到的作用。虽然目前尚未在抑制素复合物中鉴定出与线粒体 AAA 蛋白酶相关的额外蛋白质，但不能排除其相互作用的可能性，只是这种相互作用可能采用更动态的配置。这项研究为理解抑制素对线粒体内膜完整性和空间组织的功能贡献提供了坚实的结构基础，也为后续进一步研究抑制素在细胞生理和病理过程中的作用开辟了新的方向。