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为探究牙周炎发病机制，武大研究人员研究链球菌 EF-Tu，发现 simeprevir 可防治牙周炎。
牙周炎，这一全球范围内极为常见的慢性疾病，悄无声息地影响着约 20 - 50% 的全球人口。它不仅是导致成年人牙齿脱落的主要原因，还如同一条暗藏的纽带，与心血管疾病、类风湿关节炎、糖尿病等多种全身性疾病紧密相连。想象一下，口腔中那些看似微不足道的细菌，竟然能引发如此广泛的健康问题，这背后的奥秘究竟是什么呢？
原来，牙周炎的主要病因是龈下菌斑生物膜的形成和微生物群落的失调。现有治疗手段，如机械去除龈下菌斑生物膜，虽然能暂时缓解症状，但细菌的重新定植却使得牙周炎反复发作，难以根治。而且，龈下菌斑对抗菌药物具有很强的抵抗力，免疫系统也难以将其彻底清除，它还会持续引发牙周炎症反应，进一步破坏牙周组织。因此，深入了解龈下菌斑生物膜形成的机制，对于开发更有效的牙周炎治疗和预防策略至关重要。
武汉大学的研究人员勇挑重担，开展了一项意义重大的研究。他们聚焦于革兰氏阳性菌链球菌，这类细菌作为龈下菌斑生物膜的主要早期定植者，在牙周炎的发病过程中起着关键作用。目前，关于链球菌黏附机制的研究主要集中在细菌表面黏附素，但尚未发现对龈下菌斑整体早期黏附具有关键意义的蛋白质。在这样的背景下，研究人员另辟蹊径，对临床菌斑进行高通量蛋白质质谱分析，最终发现了潜在的黏附蛋白 EF-Tu。
EF-Tu 是一种蛋白质翻译延伸因子，在细胞内负责催化氨酰 - tRNA 与核糖体 A 位点的结合。令人惊奇的是，它还能分泌到细菌表面，发挥 “兼职” 功能，然而其在牙周炎中的作用此前却从未被报道过。
研究人员采用了多种关键技术方法来深入探究 EF-Tu 的奥秘。他们运用质谱分析（MS）和宏基因组测序分析，对临床样本中的蛋白质和微生物进行检测；构建了多种基因工程菌株，如 EF-Tu 基因敲除突变体（Δtuf）、EF-Tu 过表达菌株（pDL278tuf）和拯救菌株（pDL278tufΔtuf），以研究 EF-Tu 对生物膜形成和牙周炎发展的影响；利用 Micro-CT 和组织学染色技术，观察牙周炎小鼠模型中牙槽骨的变化；还通过免疫透射电镜、总内反射显微镜（TIRFM）等技术，研究 EF-Tu 的细胞定位和黏附特性。
下面让我们详细看看研究结果：
- 链球菌 EF-Tu 在牙周炎患者龈下菌斑中分泌到细胞外：研究人员收集了健康个体和牙周炎患者的唾液及龈下菌斑样本，进行质谱分析。结果发现，牙周炎患者龈下菌斑的分泌蛋白中，链球菌 EF-Tu 显著富集。进一步对口腔链球菌的主要物种进行分析，发现 S. oralis、S. gordonii 和 S. sanguinis 在牙周炎患者龈下菌斑生物膜中大量富集。以 S. oralis 为模型生物进行细菌表面蛋白质组分析，结果显示，黏附状态下的 S. oralis 分泌蛋白中 EF-Tu 的含量比浮游状态下高出 4.4 倍。这表明 EF-Tu 从黏附细菌中分泌出来，很可能在生物膜形成和牙周炎进展中发挥重要作用。
- 分泌的 EF-Tu 促进生物膜发展和牙周炎发病：研究人员构建了 Δtuf、pDL278tuf 和 pDL278tufΔtuf 菌株，通过结晶紫染色和扫描电子显微镜（SEM）分析，发现 Δtuf 菌株形成的生物膜最少，pDL278tuf 菌株形成的生物膜最多，而 pDL278tufΔtuf 菌株形成的生物膜水平与野生型（WT）菌株相似。这充分证明了细菌表面的 EF-Tu 在生物膜形成中起着关键作用。在牙周炎小鼠模型实验中，感染 Δtuf 菌株的小鼠牙槽骨吸收最少，小梁数量（Tb. N）和小梁骨体积与组织体积比（BV/TV）明显高于感染 pDL278tufΔtuf 和 WT 菌株的小鼠。组织学染色结果也显示，Δtuf 感染组的牙骨质釉质交界至牙槽嵴顶（CEJ - ABC）距离和破骨细胞浸润水平显著低于 WT 感染组，免疫荧光染色表明该组免疫细胞募集和炎症标志物表达也明显降低。这些结果表明，EF-Tu 在牙周炎的发展中起着关键作用，敲除 tuf 基因可有效抑制牙槽骨吸收，减少破骨细胞水平，减轻炎症，这意味着 EF-Tu 有望成为牙周炎治疗的新靶点。
- 分泌的 EF-Tu 促进细胞表面黏附：免疫透射电镜结果显示，浮游状态下 EF-Tu 主要存在于细胞胞质中（94.8%），而在黏附细菌中则主要定位于细胞表面（96.7%）。用异硫氰酸荧光素（FITC）标记纯化的 EF-Tu 后，通过 TIRFM 追踪其运动轨迹，发现 EF-Tu 在单位时间内移动距离比牛血清白蛋白（BSA）短，均方位移（MSD）α 值也显著低于 BSA，这表明位于细胞表面的 EF-Tu 能够直接黏附到非生物表面。将 EF-Tu-FITC 与 WT S. oralis 共同孵育后，对细菌细胞运动轨迹的分析也表明，细胞外的 EF-Tu 具有细胞表面黏附作用。此外，通过对 EF-Tu 突变体的研究发现，“桶状黏附结构域” 的突变会降低 EF-Tu 蛋白的表面黏附效果，这充分说明该结构域在 EF-Tu 的黏附功能中起着至关重要的作用。
- EF-Tu 通过膜泡分泌到细胞表面：免疫透射电镜显示，EF-Tu 通过膜泡（MVs）分泌到黏附的 S. oralis 细菌细胞表面。从 WT 菌株中提取的 MVs 能以剂量依赖的方式增强 S. oralis 的微菌落形成，而 Δtuf 菌株的 MVs 则几乎没有这种增强作用。进一步研究发现，MVs 中除了含有高水平的 EF-Tu 外，还含有已知的 MV 途径分泌蛋白 Enolase。免疫透射电镜显示，EF-Tu 和 Enolase 在生物膜培养的细菌细胞表面均有富集。通过蛋白质相互作用实验和分子动力学模拟证实，EF-Tu 与 Enolase 相互作用，并且 EF-Tu 通过 MVs 的分泌依赖于 Enolase。
- Simeprevir 抑制 EF-Tu 的细胞表面黏附作用：通过虚拟药物筛选，研究人员发现 FDA 批准的药物 simeprevir 能够结合 EF-Tu 的 “桶状黏附结构域”，抑制其黏附作用。实验表明，simeprevir 对 S. oralis 的最小抑菌浓度（MIC）为 5 μM，1 μM 的 simeprevir 就能有效抑制 S. oralis 的黏附，且不影响细胞生长。添加 simeprevir 后，细菌的黏附能力显著降低，生物膜形成也明显减少。同时，simeprevir 还能抑制 EF-Tu 与 Enolase 的相互作用，从而阻断 EF-Tu 的分泌途径。
- Simeprevir 为牙周炎提供预防和辅助治疗：在小鼠实验中，用含有 simeprevir 的溶液处理感染 S. oralis 的小鼠，Micro-CT 和组织学分析结果显示，该处理显著抑制了牙槽骨的吸收，减少了破骨细胞的浸润，有效预防了牙周炎的进展。在移植牙周炎患者龈下菌斑的小鼠模型中，添加 simeprevir 同样能够抑制牙槽骨的吸收，并且在去除结扎线后，还能促进牙槽骨的再生，辅助牙周治疗。在人体临床试验中，用 simeprevir 漱口水漱口能显著降低 Quigley - Hein 菌斑指数，减少龈下菌斑的形成，这表明 simeprevir 在预防和治疗牙周炎方面具有巨大的潜力。
综上所述，本研究首次揭示了链球菌 EF-Tu 在牙周炎发病过程中的重要作用，它通过促进细菌黏附和生物膜形成，推动了牙周炎的发展。同时，研究还发现 simeprevir 能够有效抑制 EF-Tu 的功能，为牙周炎的预防和治疗提供了新的策略。这一研究成果为深入理解牙周炎的发病机制提供了新的视角，也为开发更有效的牙周炎治疗药物开辟了新的道路，有望在未来的临床实践中发挥重要作用，帮助众多牙周炎患者摆脱疾病的困扰。
