新冠新防线：鼻喷式 PIV5 载体新冠疫苗单剂初免与加强免疫对抗 SARS-CoV-2 变异株的卓越功效

新冠病毒（SARS-CoV-2）变异株不断涌现，现有疫苗效力受影响。本文研究了副流感病毒 5（PIV5）载体鼻喷式新冠疫苗（如 CVXGA1 等）在仓鼠模型中的免疫原性和功效，发现其单剂可诱导中和抗体，加强免疫效果显著，有望成为对抗变异株的有效疫苗。

　　### 研究背景
2019 年 12 月，SARS-CoV-2 在中国武汉首次出现，此后众多变异株不断涌现。世界卫生组织将影响病毒传播、增加致病性或降低疫苗有效性（免疫逃逸）的变异株定义为关注变异株（VOC），如阿尔法（alpha）、贝塔（beta）、伽马（gamma）、德尔塔（delta）和奥密克戎（omicron）等。

目前，美国批准了四种 SARS-CoV-2 疫苗，全球已接种超 130 亿剂疫苗，但变异株的免疫逃逸和疫苗诱导的免疫力下降，使得现有疫苗对变异株的效力降低。例如，接种两剂辉瑞 mRNA 疫苗的个体血清对 delta 变异株的中和抗体滴度比对 alpha 变异株低三到五倍；奥密克戎康复者血清对奥密克戎的中和能力比对原始毒株 WA1 低八倍 。因此，迫切需要开发对变异株具有持久保护免疫力的新型疫苗。

PIV5 是副黏病毒科的一种负链单链 RNA 病毒。PIV5 载体疫苗经鼻内（IN）免疫后可在呼吸道中活跃复制，能产生抗原特异性细胞反应和黏膜免疫，包括抗原特异性 IgA 抗体和长寿的 IgA 浆细胞 。一种表达 SARS-CoV-2 武汉（原始毒株；WA1；CVXGA1）刺突蛋白的 PIV5 载体疫苗已在小鼠和雪貂中显示出有效性 ，目前正在美国进行 2 期临床评估。本研究利用金黄地鼠模型，评估 CVXGA1 及其他 PIV5 载体疫苗对 SARS-CoV-2 变异株的免疫原性和功效。

材料和方法

1. 细胞：使用 Vero E6 细胞、无血清（SF）Vero 细胞和 Vero-TMPRSS2 细胞，分别在特定培养基中培养，置于 37°C、5% CO₂环境，定期检测支原体污染，对用于生产疫苗的细胞系进行核型分析验证。
2. 质粒和病毒拯救：按照先前描述构建编码 PIV5 反基因组的质粒和重组 PIV5 。构建分别表达 SARS-CoV-2 WA1、alpha、gamma、delta 和 omicron 变异株刺突（S）基因的质粒（CVXGA1、CVXGA3、CVXGA5、CVXGA13 和 CVXGA14），以及同时表达 S 和核蛋白（N）的质粒（CVXGA2）。通过转染或电穿孔将相关质粒和 T7 聚合酶导入 SF Vero 细胞，回收并扩增病毒，用 RT-PCR 和 Sanger 测序验证病毒基因组。
3. 病毒增殖：重组 PIV5 病毒在 SF Vero 细胞中以 0.001 PFU 的感染复数（MOI）在特定培养基中培养 5 - 7 天，收获培养基离心去除细胞碎片，与缓冲液混合后分装、冻存。SARS-CoV-2 病毒在 Vero 细胞中培养，不同变异株来源不同，如 WA1 和 alpha 变异株来自 BEI Resources，omicron BA1 变异株由佐治亚大学 Jeff Hogan 博士提供，delta 变异株由华盛顿大学 Michael Gale, Jr. 博士提供。对 delta 变异株进行分离、培养和全基因组测序验证。
4. 免疫荧光测定：用 PIV5、CVXGA1 等病毒以 0.01 的 MOI 感染 Vero 细胞 3 天，固定后用特定抗体孵育，再用荧光标记的二抗孵育，最后用显微镜成像，检测病毒感染细胞中的蛋白表达。
5. 地鼠：选用 5 - 7 周龄的金黄地鼠，单笼饲养在动物生物安全二级（ABSL2）设施，自由进食和饮水。实验前在佐治亚大学的生物科学动物设施进行预处理，感染和感染后实验在 ABSL3 设施进行。实验中通过腹腔注射麻醉地鼠进行免疫、采血和感染操作。
6. 地鼠的免疫和感染：鼻内免疫时，将麻醉地鼠仰卧，用移液器将 100 μL 接种物滴在其鼻子上，使其流入呼吸道。使用从临床站点获得的 COVID-19 mRNA 疫苗，复溶后肌肉注射 2 μg/50 μL 。设置不同的研究组，如 AE19 组地鼠接受单剂鼻内免疫后，在不同时间采血、感染 SARS-CoV-2 WA1 或 alpha 变异株；AE23 组地鼠免疫后感染 delta 变异株；AE24 组地鼠进行多次免疫，包括 mRNA 疫苗和 CVXGA1 等，最后感染 delta 变异株。实验过程中监测地鼠体重变化，感染后采集肺组织检测病毒载量。
7. 酶联免疫吸附测定：用酶联免疫吸附测定（ELISA）检测地鼠血清中抗 SARS-CoV-2 S 和受体结合域（RBD）的体液反应。将 SARS-CoV-2 S 或 RBD 包被在 96 孔板上，加入地鼠血清孵育，再加入辣根过氧化物酶标记的二抗，显色后测定 OD₄₅₀值，计算抗体滴度。
8. 中和测定：在生物安全三级（BSL3）设施中进行微量中和测定，检测地鼠产生的 SARS-CoV-2 中和抗体（nAbs）。将地鼠血清热灭活后倍比稀释，与 SARS-CoV-2 WA1、delta 或 omicron 变异株混合孵育，再接种到相应细胞上，培养后固定、免疫染色，计算中和滴度。
9. 感染性病毒滴度的空斑测定：用空斑测定法检测肺匀浆中的 SARS-CoV-2 病毒滴度。将肺匀浆倍比稀释后接种到 Vero E6 细胞（针对 WA1 和 alpha 变异株）或 Vero TMPRSS2 细胞（针对 delta 和 omicron 变异株）上，培养后固定、染色，计数空斑，计算病毒滴度。
10. 定量 PCR：用 RT-qPCR 检测 SARS-CoV-2 病毒 RNA 水平。将肺匀浆与 TRIzol 混合灭活病毒，提取 RNA 后进行 qRT-PCR，根据标准曲线计算病毒载量。
11. 统计分析：使用 Prism 9.3.1 软件进行统计分析。ELISA、中和抗体和 RT-qPCR 实验通过非参数 Kruskal-Wallis 多重比较，比较疫苗组与载体对照、PBS 和 / 或 mRNA 加强组的差异；体重变化图通过 Mann-Whitney 检验比较各疫苗组与 PBS 组在每个时间点的差异。实验动物随机分组，未进行盲法处理，所有数据均纳入分析。

研究结果

1. PIV5 载体 SARS-CoV-2 疫苗的构建和表征：构建了表达不同 SARS-CoV-2 抗原的 PIV5 载体疫苗，包括表达 S 蛋白的 CVXGA1、CVXGA3、CVXGA5、CVXGA13、CVXGA14，以及同时表达 S 和 N 蛋白的 CVXGA2。通过免疫荧光测定证实了插入的 S 和 / 或 N 抗原在 Vero 细胞中的表达。
2. PIV5 载体 SARS-CoV-2 疫苗在地鼠中诱导抗 S 体液反应：单剂鼻内免疫金黄地鼠后，PIV5 载体免疫的地鼠在 28 天未检测到抗 SARS-CoV-2 S 结合抗体，而 CVXGA1、CVXGA2、CVXGA3 免疫的地鼠诱导的 ELISA 抗体滴度均值大于 16,125，CVXGA5 在较低免疫剂量下诱导的抗 S ELISA 滴度大于 9,870。
3. CVXGA 疫苗保护地鼠免受同源和异源攻击：用 SARS-CoV-2 WA1 或 alpha 变异株攻击免疫后的地鼠，PIV5 载体免疫的地鼠体重下降且未恢复，而 CVXGA1、CVXGA2、CVXGA3、CVXGA5 免疫的地鼠体重下降后在 3 - 4 天恢复到感染前水平。在两种病毒攻击组中，CVXGA2 免疫的地鼠体重增加最多。通过检测肺组织中的病毒载量发现，CVXGA1、CVXGA2、CVXGA3、CVXGA5 免疫的地鼠在攻击后未检测到感染性病毒，且病毒 RNA 水平显著低于 PIV5 载体免疫的地鼠，表明 CVXGA 疫苗能有效保护地鼠免受同源和异源病毒攻击。
4. CVXGA 疫苗保护地鼠免受 delta 变异株攻击：研究 CVXGA1、CVXGA3 和 CVXGA13 对 delta 变异株的免疫原性和功效。免疫后，三种疫苗均诱导出高水平的抗 S IgG 抗体，其中 CVXGA13 诱导的抗 WA1 RBD 抗体水平最高。攻击 delta 变异株后，CVXGA1、CVXGA3、CVXGA13 免疫的地鼠体重增加，而 PBS 免疫的地鼠体重下降。CVXGA13 免疫的地鼠体重增加最多，且三种疫苗免疫的地鼠肺匀浆中均未检测到感染性病毒，表明单剂鼻内免疫 CVXGA1、CVXGA3 和 CVXGA13 能保护地鼠免受同源和异源 delta 变异株攻击，且 CVXGA13 对同源 delta 病毒的保护效果最佳。
5. CVXGA1 产生更持久的免疫力：比较 1 次（1× CVXGA1）和 2 次（2× CVXGA1）鼻内接种 CVXGA1 与 2 次肌肉注射 mRNA COVID - 19 疫苗（2× mRNA）的免疫效果。2× mRNA 免疫的地鼠在早期抗 S ELISA 抗体滴度较高，但 2× CVXGA1 免疫的地鼠在 108 天产生更高水平的抗 WA1 中和抗体。随着时间推移，2× mRNA 免疫的地鼠抗体滴度下降明显，部分地鼠检测不到针对 WA1、delta 和 omicron 变异株的中和抗体，而 2× CVXGA1 免疫的地鼠抗体维持较好。攻击 delta 变异株后，2× CVXGA1 免疫的地鼠体重增加显著，且肺组织中的病毒 RNA 水平低于 2× mRNA 免疫的地鼠，表明 CVXGA1 免疫的动物具有更持久的免疫力。
6. 用 CVXGA 加强免疫可提高 mRNA COVID - 19 疫苗免疫地鼠的保护效果：以 2× mRNA 免疫为基础，用 CVXGA1、CVXGA13 和 CVXGA14 作为加强疫苗。加强免疫后，CVXGA 加强组的抗 S IgG 滴度更高，中和抗体水平显著高于 mRNA 加强组和未加强组。攻击 delta 变异株后，CVXGA14 或 CVXGA1 加强免疫的地鼠体重增加最佳，且所有加强免疫组的肺匀浆中均未检测到感染性病毒，但 CVXGA 加强组的病毒 RNA 水平最低，表明 CVXGA 作为加强疫苗可显著提高对变异株的保护效果。

讨论

CVXGA1 鼻喷式疫苗已在小鼠和雪貂中证明对 SARS-CoV-2 WA1 有效，但 WA1 已不再全球流行，评估疫苗对 VOCs 的免疫效果至关重要。本研究虽未对 omicron 进行攻击实验，但通过测量 omicron 特异性交叉中和抗体，证明单剂 CVXGA1 可保护地鼠免受同源 WA1 和异源 alpha、delta 病毒攻击，且 CVXGA2 因表达 S 和 N 抗原提供了更强的保护。

美国约 81% 的人口已接种 COVID-19 疫苗，但现有疫苗对变异株效力降低。本研究表明，用 CVXGA1 加强免疫 2× mRNA 免疫的地鼠，可显著提高抗 WA1 S 抗体水平和针对 WA1、delta、omicron 变异株的中和抗体滴度，优于 mRNA 加强免疫，说明 CVXGA1 可增强已接种个体对 VOCs 的免疫力。

由于免疫逃逸增加，更新 COVID-19 疫苗以应对当前流行的 VOCs 很有必要。本研究还评估了表达不同变异株 S 蛋白的 PIV5 载体疫苗的免疫原性和保护效果，发现接种 PIV5 载体 delta 变异株 S 蛋白（CVXGA13）的地鼠在攻击 delta 变异株后体重增加最多，且用 PIV5 载体 delta 或 omicron S 蛋白加强免疫可显著提高中和抗体水平，表明 PIV5 载体疫苗可作为针对 VOCs 的加强疫苗。

本研究存在局限性，未在地鼠模型中研究黏膜和细胞免疫，因相关试剂有限且数据不可靠。但在非人类灵长类（NHP）模型中已证明 CVXGA1 可在上呼吸道和下呼吸道提供显著保护，并诱导细胞和黏膜免疫。

此外，针对病毒载体疫苗存在的预存载体特异性免疫问题，先前研究表明约 30% 的人类对 PIV5 呈血清阳性，但 PIV5 载体疫苗可克服犬的预存抗 PIV5 免疫力。本研究中，CVXGA1 在仓鼠模型中展现出良好的保护和加强免疫效果，其在人体中的效果正在临床试验中评估。

目前已有多种鼻喷式 COVID-19 疫苗在临床或临床前研究中，部分鼻喷式疫苗的免疫原性优于肌肉注射。印度批准的腺病毒载体疫苗 iNCOVACC、中国批准的腺病毒载体疫苗康希诺（Convidecia）和流感病毒载体疫苗 dNS1-RBD，为鼻喷式疫苗平台带来了希望。

总之，正在美国进行人体临床试验评估的鼻喷式疫苗 CVXGA1，无论是对未免疫还是已接种 mRNA 疫苗的地鼠，单剂即可有效保护其免受同源和异源 SARS-CoV-2 变异株的攻击。研究数据表明，CVXGA1 及其他 PIV5 载体 COVID-19 疫苗可作为有效的异源加强疫苗，为已接种 COVID-19 mRNA 疫苗的个体提供持久的交叉反应免疫力。