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为解决传统多色成像技术在观察细胞器时存在的分辨率低、速度慢、通量低及荧光标记难题，研究人员开展了活细胞内细胞器的快速分割与多重成像研究。结果表明，该方法能精准分割 15 种亚细胞结构，意义在于为研究细胞器相互作用提供有力工具。
在细胞生物学的微观世界里，细胞器如同一个个精密的小工厂，它们相互协作，维持着细胞的正常运转。然而，想要深入了解这些细胞器之间的互动关系，却并非易事。传统的多色成像技术，就像戴着有色眼镜看世界，存在诸多限制。一方面，可分辨的颜色数量远远少于细胞器的种类，难以同时观察多种细胞器；另一方面，荧光标记过程繁琐，还容易受到光谱串扰和光毒性的影响，使得成像质量大打折扣。此外，超分辨率荧光显微镜技术在进行多色成像时，也只能实现有限的颜色分辨，无法满足研究需求。在这样的背景下，对细胞器相互作用组（interactome）的研究迫切需要一种新的方法来突破这些困境。
为了解决这些问题，来自北京大学、浙江东方理工大学、清华大学、中国农业大学、悉尼科技大学等多个机构的研究人员携手开展了一项关于活细胞内细胞器的快速分割与多重成像的研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员采用了一系列先进的技术方法。在成像设备方面，使用了具有扩展分辨率（约 143nm）的旋转盘显微镜（spinning-disk microscopes），这种显微镜能够有效抑制离焦荧光信号，提高信噪比，为定量分析提供了良好的基础。染色试剂上，选择了尼罗红（Nile Red），它可以高效地标记多种细胞内膜结构，且具有环境敏感性，其发射光谱会根据膜的脂质极性发生变化。在数据分析环节，运用深度卷积神经网络（deep convolutional neuronal networks, DCNN）对图像进行处理。
研究结果如下：
- 尼罗红染色和旋转盘显微镜成像的稳健性：尼罗红染色操作简便，对多种脂质膜具有靶向性和环境敏感性。通过不同成像模态、多种样本及成像条件的测试，发现尼罗红染色的光谱比值在不同条件下保持稳定，不受细胞系、光照强度和曝光时间变化的影响，可作为可靠的 “光学指纹” 用于细胞器类型的分割。
- DCNN 网络的输入和真值：DCNN 网络的输入包括强度图像和红 / 黄比值图像，比值图像反映了细胞器膜的脂质极性，有助于提高网络对相似形态细胞器的分割精度。通过 GFP 质粒标记特定细胞器获取真值图像，再经 FG-net 网络分割前景区域得到真值掩码（ground truth mask），同时手动标注部分结构的掩码，为网络训练提供准确数据。
- 利用 DCNN 网络分割细胞内区室：研究人员训练了 10 个 DCNN 网络，成功分割出 15 种细胞内区室，包括细胞质（cytosol）、细胞核（nucleus）、内质网（endoplasmic reticulum, ER）、高尔基体（Golgi apparatus）、线粒体（mitochondria, MITO）等。采用基于注意力 U-Net 架构的网络进行训练，根据不同网络类型选择合适的激活函数和损失函数，并通过数据增强和调整类权重等方法提高网络性能。
- 分割性能评估：通过对比真值掩码和网络输出掩码，3D 数据集的所有细胞内结构像素准确率超过 91.7%。使用 F1 分数、召回率和精确率等指标评估，二元分割网络对高尔基体、脂质滴（lipid droplet, LD）等细胞器的分割效果良好，多类分割网络在多数情况下正确预测像素比例大于 60%。“虚拟” 多（伪）色图像的评估显示，大多数结构与真值具有较强或良好的共定位。与其他成像模态的细胞器分割结果相比，该研究方法性能更优或相当，且光谱比值图像对相似形态的囊泡细胞器分割精度提升有重要作用。
- 不同仪器和细胞类型的细胞器分割结果：DCNN 网络在不同显微镜和细胞类型上具有较好的泛化能力。在不同显微镜测试中，多数网络能保持良好的共定位结果，部分网络经迁移学习后可显著提高预测准确性。在不同细胞类型测试中，用 U2-OS 数据集训练的网络对 COS7 和 Hela 数据集有一定的预测能力，添加少量相应数据进行迁移学习后，预测精度明显提高。此外，该方法还成功应用于果蝇幼虫睾丸组织的成像，实现了复杂多细胞样本中细胞内细胞器的六色成像。
- 细胞有丝分裂阶段的细胞解剖成像：基于旋转盘显微镜的扩展空间分辨率结果，利用 “虚拟” 多色成像研究了活 U2-OS 细胞在有丝分裂各阶段的 3D 解剖结构。DCNN 网络能准确分割大多数细胞器，研究发现不同细胞器在有丝分裂各阶段呈现出不同的形态和分布变化，如细胞核在不同时期的清晰度变化，ER、高尔基体等细胞器的结构和体积改变等，还对细胞内结构进行了统计分析。
- 细胞器相互作用组的快速成像：运用深度学习增强的扩展分辨率分割方法研究细胞器相互作用组。通过 2D 图像采集，能在一次曝光中可靠地获得六种结构（包括五种膜细胞器和微管结构）的高吞吐量成像，相比传统方法成像通量提高了 6 - 26 倍。利用尼罗红染色和 DCNN 网络，揭示了多个细胞内细胞器之间的未知相互作用，如线粒体的裂变和融合过程、脂质滴与微管的相互作用等。
研究结论和讨论部分指出，该研究提出的使用通用脂质染料染色结合 DCNN 网络的方法，克服了传统荧光成像技术的诸多局限，为活细胞内多个细胞器的快速、稳健分割和多重成像提供了有效途径。尽管该技术存在一些局限性，如 DCNN 网络准确性受真值数据影响，在细胞器形态和脂质膜组成变化较小的情况下现有网络可直接应用，否则需添加训练数据；在细胞内密集区域，尤其是细胞核附近，分割精度可能下降，需要高分辨率成像和背景去除能力更强的技术获取高质量原始图像等。但该技术前景广阔，有望利用深度学习的降噪能力实现细胞的长期观察和复杂活组织的大视野多色成像，还可通过结合其他策略对无膜细胞器进行成像，进一步拓展研究范围。这项研究成果为细胞生物学领域对细胞器的研究提供了新的有力工具，有助于深入理解细胞内的微观世界，推动生命科学的发展。
