短环工程策略：提升酶热稳定性的创新之道

在酶工程领域，提升酶热稳定性至关重要。研究人员开展 “短环工程策略增强酶热稳定性” 研究，通过挖掘短环上刚性 “敏感残基” 并突变填充空腔，使三种酶（PpLDH、UOX、LDHD）半衰期显著延长，还提出标准流程和可视化插件。

　　在生物催化和合成生物学的舞台上，酶就像一群神通广大的 “小精灵”，作为高效的催化剂，它们发挥着至关重要的作用。酶的热稳定性更是如同它们的 “魔法护盾”，不仅关乎人类健康，在工业应用领域也有着举足轻重的地位。想象一下，在工业生产中，酶的热稳定性高，就意味着它们可以反复使用，使用寿命延长，这能大大降低生产成本。而且，在较高温度下，酶促反应的速度会加快，底物的溶解度也会增加，微生物污染的风险还能降低，简直是一举多得！

然而，提升酶的热稳定性可不是一件容易的事。过去，虽然有很多策略致力于增强酶的稳定性，比如定向进化、B - 因子策略，还有各种计算工具和技术，但这些方法都存在一些局限性。有的无法覆盖所有关键位点，有的则会忽略某些对蛋白质稳定性至关重要的刚性区域。

为了解决这些问题，北京化工大学的研究人员踏上了探索之旅，开展了一项关于 “短环工程策略增强酶热稳定性” 的研究。他们提出的短环工程策略就像是给酶的热稳定性打造了一把 “神奇钥匙”。研究人员通过探索短环区域的刚性 “敏感残基”，然后把这些残基突变成具有大侧链的疏水残基，用来填充蛋白质结构中的空腔，以此来提高酶的热稳定性。

这项研究意义非凡。它成功地在三种酶上进行了验证，分别是来自戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）的乳酸脱氢酶（PpLDH）、来自黄曲霉（Aspergillus flavus）的尿酸氧化酶（UOX）和来自肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）的 D - 乳酸脱氢酶（LDHD）。在短环工程策略的指导下，这三种酶的半衰期分别比野生型提高了 9.5 倍、3.11 倍和 1.43 倍 。而且，研究人员还提出了该策略的标准流程，开发了可视化插件，为酶稳定性的修饰提供了全新的思路和方法，就像为酶工程领域打开了一扇新的大门，照亮了未来的研究方向。这一成果发表在《iScience》杂志上，引起了广泛关注。

研究人员在开展这项研究时，运用了多种关键技术方法。在蛋白质结构研究方面，利用 AlphaFold2 构建高精度蛋白质模型；通过 Gromacs 进行分子动力学模拟，分析蛋白质和残基的波动情况；借助 FoldX 计算折叠自由能，评估突变对蛋白质稳定性的影响；使用 PyMOL 进行蛋白质结构可视化和分析。这些技术相辅相成，为研究的顺利开展提供了有力支持。

下面我们来详细看看研究结果：

• 探索短环工程中的 “关键位点”：研究人员以 PpLDH 为研究对象，采用基于折叠自由能计算的虚拟饱和筛选策略，在其短环区域找到了关键位点 Ala₉₉。对 Ala₉₉进行饱和突变实验发现，许多突变都能提高蛋白质稳定性。比如，突变为 Glu（99E）和 Asp（99D）时，能通过与 Arg₁₅₄形成新的氢键来增强稳定性；突变为 Met、Tyr、Phe、Trp 等大侧链疏水残基时，能填充 Ala₉₉形成的空腔，增强疏水相互作用，进而提高稳定性。
• 短环工程的特点：
  • 短环区域的空腔：PpLDH 中 Ala₉₉位点存在一个体积为 265 ?³的空腔，用大侧链残基填充后，稳定性增强，说明短环上的残基通过形成空腔影响蛋白质稳定性，填充空腔可提高稳定性。
  • 疏水相互作用增强蛋白质稳定性：PpLDH 短环区域围绕 Ala₉₉的残基具有较强的疏水相互作用，将 Ala₉₉突变为大侧链疏水残基后，该区域的疏水相互作用进一步增强，为蛋白质整体结构提供了更刚性的支撑。
  • 短环工程通过识别刚性区域内的敏感残基增强稳定性：分子动力学模拟显示，Ala₉₉所在的短环区域刚性较高，其均方根波动（RMSF）值低于平均水平，B - 因子策略可能会忽略该位点。但填充该位点的空腔后，蛋白质稳定性显著提高。
  • 短环工程提高其他结构域的刚性：对 PpLDH 的 Ala₉₉位点进行突变和动力学模拟分析发现，A99Y 突变主要影响 123 - 137 区域的整体稳定性，而非自身的刚性或柔性，这与 B - 因子策略不同。
  • 对附近残基自由运动的影响：野生型 Ala₉₉位点的空腔使 Arg₁₅₄侧链能自由移动，而突变为 Tyr 填充空腔后，限制了 Arg₁₅₄侧链的移动，这是蛋白质稳定性增加的关键原因。
  • 折叠自由能：计算 A99F、A99Y 和 A99W 突变体的折叠自由能（ΔΔG），结果均为负值，表明这些突变倾向于增强蛋白质稳定性，该指标可作为未来短环工程设计的评估标准。
  
  
• 利用短环工程增强 UOX 的热稳定性：研究人员对 UOX 进行 100 ns 分子动力学模拟后，在其短环区域发现敏感残基 Thr₇₅。Thr₇₅两侧为疏水残基，因其侧链小形成了体积为 884 ?³的空腔。用芳香族残基 Phe、Tyr、Trp 填充空腔后，如 T75W 突变体，部分填充了空腔，减小了其体积。分子动力学模拟显示，Thr₇₅位点刚性高，突变影响了 261 - 277 区域的整体波动，降低了附近 Tyr₃₁的波动，提高了蛋白质稳定性。T75W 突变体在 40°C 下的半衰期比野生型延长了 3.1 倍。
• 利用短环工程增强 LDHD 的热稳定性：在 LDHD 的短环区域，研究人员发现 Glu₁₈₇是敏感残基，其两侧为连续疏水残基，形成了体积为 150 ?³的空腔。用 Phe 填充空腔后，减小了空腔体积。分子动力学模拟表明，Glu₁₈₇位点刚性高，突变影响了 121 - 140 区域的整体波动，降低了附近 Lys₁₆₄的波动。在 60°C 下，E187F 突变体的半衰期从 27.4 分钟增加到 39.2 分钟。
• 短环工程的标准化流程：研究人员发现短环工程策略具有一定的通用性，于是开发了标准化和可视化的工作流程。首先用 AlphaFold3/AlphaFold2 构建高精度蛋白质模型；然后用 PyMOL 可视化蛋白质结构，初步确定短环区域敏感残基位置；最后通过分子动力学模拟和计算折叠自由能进行虚拟筛选，满足条件的进行异源表达和体外稳定性测试验证。此外，还开发了名为 “Cavity Finder” 的 PyMOL 插件，可自动定位短环区域的空腔。

在研究结论和讨论部分，研究人员指出，短环在蛋白质结构中起着连接结构域的重要作用，但因其刚性常被稳定性增强策略忽视。他们在 PpLDH、UOX 和 LDHD 中发现了短环敏感残基，填充其形成的空腔后提高了蛋白质稳定性，并开发了相关策略和插件。这一研究强调了具有刚性结构的短环在蛋白质稳定性中的关键作用，与常见的针对柔性区域不稳定残基的设计策略不同，为增强蛋白质热稳定性提供了新的方向。然而，研究也存在一定局限性，目前只能通过动力学模拟来表征蛋白质在溶剂环境中突变前后结构动力学的变化，无法直接观察填充空腔后蛋白质波动性的改变。尽管如此，这项研究依然为酶工程领域的发展做出了重要贡献，为未来进一步优化酶的性能奠定了坚实基础。