CRISPR-Cas9 敲除 DGKα/ζ：为卵巢癌 CAR-T 细胞疗法带来新希望

为解决实体瘤 CAR-T 细胞疗法疗效受限问题，研究人员开展敲除 DGKα/z 对 TAG-72 CAR-T 细胞治疗卵巢癌影响的研究，结果显示可增强疗效，为癌症治疗提供新方向。

　　

一、研究背景：攻克卵巢癌治疗难题的新征程

在癌症治疗领域，卵巢癌如同一个顽固的 “堡垒”，严重威胁着女性的生命健康。它不仅有着高复发率，还对化疗产生了抵抗，常规治疗手段常常陷入困境。近年来，嵌合抗原受体 T 细胞（CAR-T）疗法在治疗 B 细胞恶性肿瘤方面取得了显著成果，如同黑暗中的曙光，给癌症治疗带来了新希望。然而，当这一疗法应用于实体瘤时，却遭遇了重重挑战。肿瘤抗原的异质性使得 CAR-T 细胞难以精准 “瞄准” 癌细胞；肿瘤微环境（TME）中的免疫抑制机制，就像一道道 “防线”，阻碍着 CAR-T 细胞发挥作用，导致其在实体瘤治疗中的疗效大打折扣。

为了突破这些困境，研究人员不断探索新的方法。二酰甘油激酶（DGK）家族在 T 细胞功能调节中起着重要作用，其中 DGKα 和 DGKζ 是 T 细胞中主要的同工型，它们如同 “刹车” 一般，抑制 T 细胞的活性。肿瘤相关糖蛋白 72（TAG-72）在卵巢癌等腺癌中高度表达，是一个极具潜力的治疗靶点。基于此，研究人员大胆假设，通过敲除 DGKα 和 DGKζ，能否为 TAG-72 CAR-T 细胞疗法 “解锁” 更强的抗癌能力，从而攻克卵巢癌治疗的难题呢？带着这样的疑问，来自澳大利亚 Cartherics Pty Ltd、澳大利亚再生医学研究所等机构的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在《Molecular Therapy Oncology》杂志上，为卵巢癌的治疗带来了新的曙光。

二、研究方法：开启探索之旅的 “钥匙”

研究人员采用了一系列先进的技术方法来开展这项研究。首先，通过慢病毒转导技术，将编码抗 TAG-72 单链可变片段（scFv）的基因导入人 T 细胞，构建了 TAG-72 CAR-T 细胞。接着，运用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术，对 CAR-T 细胞中的 DGKα 和 DGKζ 基因进行敲除。为了评估基因编辑的效果，使用了 Inference of CRISPR Edits（ICE）分析等技术检测插入或缺失（indels）频率和基因敲除（KO）效率。同时，通过蛋白质免疫印迹（Western blot）检测蛋白表达水平，利用流式细胞术分析 T 细胞亚群和细胞表面标志物。在功能研究方面，运用实时细胞分析系统（xCELLigence）评估细胞的体外杀伤能力，通过细胞因子芯片检测细胞培养上清中细胞因子的水平。此外，建立了卵巢癌非肥胖糖尿病 / 重症联合免疫缺陷 γ（NSG）小鼠异种移植模型，在体内评估 CAR-T 细胞的抗肿瘤活性，并通过免疫组织化学（IHC）分析肿瘤组织中的细胞浸润情况。研究样本来自澳大利亚红十字会生命血液中心提供的健康供者的全血或血沉棕黄层样本。

三、研究结果：探索之旅的重要发现

1. TAG-72 CAR/DGKa/z KO T 细胞的特性：研究人员成功构建了 TAG-72 CAR/DGKa/z KO T 细胞。慢病毒转导后，人 T 细胞高效表达 CAR，且 DGKa 和 DGKz 的导向核糖核酸（gRNA）能诱导高频率的 indels 和 KO，同时减少了 DGKa 和 DGKz 蛋白的表达。进一步分析发现，TAG-72 CAR/DGKa/z KO T 细胞的 T 细胞亚群分布与对照组相似，以 CD4⁺细胞和效应记忆（CCR7^-/CD45RO⁺）细胞为主，且 T 细胞耗竭标志物的表达水平也与对照组相当。
2. 体外增殖和杀伤能力：敲除 DGK 基因对 CAR-T 细胞的总体活力和增殖潜力没有显著影响。虽然在电穿孔后的初期，细胞活力和扩增出现短暂下降，但 9 天的扩增后，其活力和总细胞数与对照组相当。体外杀伤实验表明，TAG-72 CAR/DGKa/z KO T 细胞能够选择性地杀死 TAG-72^mid的卵巢癌细胞（OVCAR-3 细胞），但对 TAG-72^low的卵巢癌细胞（MES-OV）无明显杀伤作用，这说明敲除 DGK 不影响其体外杀伤的特异性。
3. 细胞因子谱：在与靶细胞共培养后，研究人员检测了细胞培养上清中细胞因子、趋化因子和生长因子的水平。结果发现，与未编辑的 T 细胞相比，TAG-72 CAR-T 细胞分泌的白细胞介素（IL）-1β 水平显著升高，而 TAG-72 CAR/DGKa/z KO T 细胞进一步增强了这一反应。此外，TAG-72 CAR/DGKa/z KO T 细胞还显著增加了粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子 α（TNFα）的分泌，同时提高了巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-1α、MIP-1β 等趋化因子的水平，这些都表明 DGK 的缺失可能增强免疫细胞的招募和激活。同时，一些生长因子如血小板衍生生长因子 BB（PDGF-BB）、碱性成纤维细胞生长因子（FGF basic）和粒细胞集落刺激因子（GCSF）的水平也显著升高，提示 DGK 缺失可能促进细胞增殖和组织重塑。
4. 体内抗肿瘤活性：在卵巢癌 NSG 小鼠异种移植模型中，研究人员评估了 TAG-72 CAR/DGKa/z KO T 细胞的体内抗肿瘤活性。结果显示，接受 TAG-72 CAR-T 细胞治疗的小鼠最初表现出较强的抗肿瘤反应，但在第 40 天左右出现肿瘤复发；接受单 DGK 敲除的 CAR-T 细胞治疗的小鼠，肿瘤复发时间稍有延迟；而接受 TAG-72 CAR/DGKa/z KO T 细胞治疗的小鼠，在长达 100 天的实验期间，肿瘤持续被根除，未出现复发，且生存优势明显。免疫组化分析显示，TAG-72 CAR/DGKa/z KO T 细胞治疗的小鼠肿瘤部位有大量人 CD3⁺ T 细胞浸润，而未编辑 T 细胞治疗的小鼠肿瘤部位则无 CD3⁺细胞，且肿瘤生长明显。

四、研究结论与讨论：照亮卵巢癌治疗的 “灯塔”

本研究利用 CRISPR-Cas9 技术成功敲除了 DGKα 和 DGKζ，构建了 TAG-72 CAR/DGKa/z KO T 细胞。这些细胞在体外和体内都展现出了强大的肿瘤杀伤能力，能够有效根除已建立的肿瘤，并且在 100 天内未出现复发，其疗效显著优于未敲除的 TAG-72 CAR-T 细胞。这一成果为卵巢癌等 TAG-72⁺癌症的治疗提供了新的潜在策略。

然而，研究人员也清醒地认识到，虽然敲除 DGKα 和 DGKζ 展现出了巨大的潜力，但在将这些基因编辑的 CAR-T 细胞应用于临床之前，还需要仔细评估其安全性。例如，基因编辑可能导致脱靶致癌事件，因此需要进行基因组监测，如 GUIDE-Seq、全基因组测序和 / 或染色体易位分析等。此外，还可以通过临床前研究，如细胞因子非依赖性增殖试验或软琼脂集落形成试验，评估这些细胞的潜在致瘤性。在临床应用中，通过定期采血监测这些细胞的增殖和持久性也是至关重要的。

总体而言，这项研究为卵巢癌的治疗开辟了新的道路，为 CAR-T 细胞疗法在实体瘤治疗中的应用提供了重要的理论依据和实践参考。未来，随着研究的不断深入，有望进一步优化这一治疗策略，为更多癌症患者带来治愈的希望。