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研究人员探究猪肩袖肌腱（RCT）研究中 western blot 分析的理想内参蛋白，发现 14-3-3ζ 表现稳定，意义重大。
在人体的肩部，肩袖肌腱（Rotator Cuff Tendon，RCT）对于维持肩部关节的稳定以及实现精准的日常活动至关重要。然而，像高血脂这类代谢性疾病，却悄然威胁着它的健康。高血脂时，血液中升高的脂质水平会对肌腱的生理状态产生不良影响，导致肌腱发生退行性变化，破坏其结构、机械性能和整体弹性。这不仅影响着人们的日常活动，还可能引发一系列健康问题。
在研究肌腱相关疾病的分子机制时，western blot 分析是一种强大的工具，它能够特异性和灵敏地定量蛋白质表达水平。而选择合适的内参基因，对于准确归一化目标蛋白表达起着关键作用。常用的内参基因如甘油醛 - 3 - 磷酸脱氢酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）和 β- 肌动蛋白（β-actin），在不同的实验条件下，其表达稳定性可能会受到多种因素的影响，如组织类型、物种差异、实验方案和试剂变异性等。在对猪肩袖肌腱组织进行研究时，研究人员发现这些常用内参基因的表达并不稳定，这给准确分析蛋白质表达带来了困难。
为了解决这一问题，美国西部卫生科学大学太平洋骨科医学院转化研究系的研究人员 Resmi Rajalekshmi、Vikrant Rai 和 Devendra K. Agrawal 开展了相关研究。他们旨在寻找一种在正常和高血脂条件下，都能稳定表达的内参基因，为猪肩袖肌腱研究中的 western blot 分析提供可靠的标准化依据。该研究成果发表在《Molecular and Cellular Biochemistry》上。
研究人员用到的主要关键技术方法包括：选用 4 到 7 个月大、体重在 20 - 30kg 的尤卡坦小型猪作为实验动物模型，从不同处理组的猪获取肩袖肌腱组织样本；采用 RIPA 裂解和提取缓冲液结合蛋白酶抑制剂鸡尾酒对肌腱组织进行处理，提取总蛋白；运用 Bradford 方法测定蛋白浓度，进行 SDS 凝胶电泳和转膜操作；通过免疫印迹技术，使用特定的一抗和二抗，检测不同内参蛋白的表达情况。
验证 western blot 的上样对照
研究人员对多个常用内参基因的蛋白表达情况进行检测。GAPDH 在正常和高血脂猪中的表达水平存在差异，出现了预期 37kDa 的条带，同时在 75 - 100kDa 范围有微弱条带，可能是翻译后修饰产生的短肽异构体。β-actin 在两组动物中均有 42kDa 的条带，但表达不一致，还出现了 25kDa 的条带，可能是降解片段或未知异构体。α- 微管蛋白（α-tubulin）在正常血脂猪的肌腱组织中有 55kDa 的预期条带，而在高血脂猪中缺失；β- 微管蛋白（β-tubulin）预期的 52kDa 条带未出现，而是观察到 25kDa 和 18kDa 的条带，可能是抗体交叉反应导致。泛素 C（Ubiquitin C，UBC）在猪肩袖肌腱组织中出现了 25kDa、60kDa 和 140kDa 的条带，对应不同长度的泛素，高血脂猪肌腱中这些多聚泛素链显著减少。亲环蛋白 A（Peptidylprolyl Isomerase A，PPIA，也称为 Cyclophilin A）在正常血脂猪样本中约 20kDa 的条带较微弱但一致，高血脂猪中仅部分样本可见，还出现了未报道过的 37kDa 和 47kDa 条带。TATA 结合蛋白（TATA-box binding protein，TBP）在两组中均有 38kDa 的单体形式条带，但表达水平有差异，150kDa 的四聚体形式条带在部分高血脂动物中缺失。
14-3-3ζ 作为内参蛋白的稳定性
14-3-3ζ 单体形式在不同猪样本中的表达不一致，但在正常和高血脂组中，均有一条稳定表达的 56kDa 条带，为其共价交联同源二聚体。通过光密度分析证实，该条带在两组间无显著差异。此外，用 TAK-242（一种选择性 TLR4 抑制剂）处理猪后，14-3-3ζ 的表达不受影响，进一步证明了其作为稳定内参蛋白的可靠性。
研究结论和讨论部分指出，准确选择内参基因对于 western blot 分析至关重要，尤其是在研究如高血脂这类病理条件时。常用的内参蛋白在猪肩袖肌腱组织中表达存在显著差异，而 14-3-3ζ 在正常和高血脂条件下均表现出稳定的表达模式，是猪肩袖肌腱研究中 western blot 分析的可靠内参蛋白。这一发现为生物医学研究，特别是肌肉骨骼疾病和治疗干预的研究，提供了有价值的方法学见解。不过，该研究样本量较小，未来研究可扩大样本范围，并对其他类型的肌腱组织进行研究，进一步验证 14-3-3ζ 作为内参基因在肌腱研究中的可靠性。
