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这篇研究聚焦人体肠道微生物。Eubacterium limosum能产生有益短链脂肪酸（SCFAs），其过程涉及含钨酶。研究发现 Tub 蛋白可存储钨，为含钨酶供钨。TOBE 家族蛋白在肠道微生物中广泛存在，参与钨和钼的存储、运输和调控，对理解肠道微生物组意义重大。
引言
人体肠道微生物组对人体健康影响广泛，涉及多种疾病。金属钼（Mo）在生物学中应用广泛，而与之类似的钨（W）在人体肠道微生物组中的作用逐渐受到关注。钨酶可能参与氧化有毒醛类，理解肠道微生物的钨代谢对人体健康研究有重要意义。
在微生物世界中，W 和 Mo 的转运由不同的 ATP 依赖型 ABC 转运蛋白负责。TupABC 特异性转运钨酸盐（WO42?） ，WtpABC 可转运钼酸盐（MoO42?）和钨酸盐，ModABC 主要转运钼酸盐，也能转运钨酸盐。Mo 被广泛用于多种酶中，而含 W 的酶相对较少，已知的有含钨氧化还原酶（WOR）和甲酸脱氢酶（FDH）等。
Mo 在微生物中的存储机制已被深入研究，多数微生物利用 molbindin 家族蛋白结合钼酸盐，这些蛋白含有 TOBE（transport - associated oligonucleotide/oligosaccharide binding type 1）结构域。相比之下，钨酸盐结合蛋白的生理功能尚未明确。
Eubacterium limosum是人体肠道中的优势微生物，能利用乳酸产生有益的 SCFAs，这一过程涉及钨酶。其基因组编码多种与钨代谢相关的蛋白，且优先摄取 W 而非 Mo。本研究旨在探究E. limosum中 W 的存储机制，以及 TOBE 结构域蛋白在其中的作用。
结果
- Tub 在E. limosum中存储钨酸盐：在添加钨酸盐和钼酸盐的葡萄糖培养基中培养E. limosum，通过阴离子交换柱和尺寸排阻色谱（SEC）分析发现，一种 70 个氨基酸、含 TOBE 结构域的蛋白是主要的含钨蛋白，命名为 Tub。重组 Tub（rTub）在体外与钨酸盐孵育后，每个六聚体可结合 7.8 ± 0.1 个钨原子，且在体外也能结合钼酸盐，但E. limosum细胞在生理条件下优先摄取 W，表明 Tub 的生理作用是结合钨酸盐。
- Tub 的钨酸盐结合特性：rTub 与钨酸盐孵育，在≥40 μM W 时，在天然迁移率变动分析中完全迁移，表明 W 与单体的饱和摩尔比为 8:1。W 负载的 Tub 在 98°C 加热 10 分钟不发生变性。等温滴定量热法（ITC）分析显示 Tub 有两个不同的钨酸盐结合位点，估计结合常数Ka为 1.00 pM，W 与 Tub 的饱和摩尔比为 1.44 ± 0.04:1。rTub 对胰蛋白酶消化有抗性，经三氯乙酸（TCA）处理后转变为胰蛋白酶敏感的单体形式。rTub 与钼酸盐结合时也表现出类似的饱和行为、热稳定性和胰蛋白酶抗性。
- Tub 的晶体结构和钨酸盐结合模型：解析了钨酸盐结合的 rTub 的 X 射线晶体结构，分辨率为 1.85 ?。Tub 主要由 β - 链（59.1%）组成，形成二聚体和六聚体结构。Tub 有八个钨酸盐结合位点，其中两个（type - 1）位于六聚体的相对两极，六个（type - 2）位于相邻单体的界面。基于不同钨酸盐占据情况的晶体结构，提出了钨酸盐与 Tub 的结合模型，即钨酸盐随机结合到 type - 1 和 type - 2 位点，最后一个结合位点位于三聚体中心。
- Tub 为钨酶积累钨酸盐：在葡萄糖培养基中生长的E. limosum，Tub 是主要的含 W 蛋白，此时钨酶 WOR1 和 FDH 的活性较低；在乳酸培养基中生长时，WOR1 和 FDH 活性显著增加，而 Tub 和钨酸盐转运蛋白 TupABC 的表达水平无明显变化。构建?tub缺失菌株发现，在葡萄糖培养基中，突变株生长速度较慢，在高浓度钨酸盐下更明显，表明 Tub 可能参与过量钨酸盐的解毒；在乳酸培养基中，野生型和突变株生长无显著差异。这证实了 Tub 在葡萄糖生长细胞中的钨积累作用。
- 人体肠道微生物组中 TOBE 家族和钨相关基因的生物信息学分析：在统一人类胃肠道基因组（UHGG v2.0.2）数据库中，共鉴定出 46,986 个含 TOBE 结构域的蛋白，分布在 25,608 个非冗余基因组中。根据 InterPro 搜索其他结构域，将这些蛋白分为 16 种独特的结构域架构（DAs），其中 7 种 DAs 代表了 94% 的 TOBE 结构域蛋白，预测其主要参与 W 或 Mo 的存储（28%）、运输（28%）或调控（38%）。通过分析物种代表基因组中其他 W/Mo 相关基因（ModA、TupA 和 WOR）的存在情况，预测含 TOBE 结构域蛋白结合 W 或 Mo 的可能性，发现预测使用 W 和使用 Mo 的物种代表数量相似。
讨论
E. limosum的 Tub 蛋白被证明具有存储钨酸盐的功能，其对钨酸盐和钼酸盐的结合亲和力比其他已知的含 TOBE 结构域的钼结合蛋白更高。推测 Tub 可能直接从 TupABC 转运蛋白接收 W，但 Tub 如何释放钨酸盐用于 WOR 和 FDH 中尚不清楚。
生物信息学分析表明，含 TOBE 结构域的蛋白在人体肠道微生物中广泛且保守，根据基因组中其他 W 或 Mo 相关基因的存在情况可推断其结合的金属。总体而言，使用 W 和使用 Mo 的物种代表中，含存储 TOBE 结构域的数量相当，但不同的 DAs 在 W 或 Mo 利用的物种代表中的分布有所不同。这表明含 TOBE 结构域的蛋白在人体肠道微生物中具有多种功能，参与 W 和 Mo 的存储、运输和调控。
材料和方法
- E. limosum的培养：E. limosum ATCC 8486 在含有特定成分的培养基中，于 35°C，在不同碳源（葡萄糖或乳酸）和不同浓度的钼酸盐、钨酸盐条件下培养，培养方式包括血清瓶、96 孔板和发酵罐培养，培养后离心收获细胞并保存。
- 天然 Tub 的纯化和鉴定：所有纯化步骤在厌氧条件下进行。发酵罐培养的细胞经裂解、离心后，上清液经 Q Sepharose high - performance（QHP）柱和 Bio - Rad Enrich SEC 650 柱纯化，测定蛋白浓度、Mo 和 W 含量以及酶活性。
- 重组 Tub 的表达和纯化：将tub基因克隆到 pET - 24a (+) 质粒，转化到E. coli Rosetta BL21 (DE3) 中诱导表达。细胞经裂解、离心后，上清液与 Strep - Tactin Superflow Plus 树脂结合，洗脱后浓缩 rTub，并进行定量和质谱分析。
- 敲除菌株的构建：使用 NEBuilder HiFi assembly master mix 组装线性 DNA 片段，包含ermB基因和tub基因上下游同源区域，转化到野生型E. limosum中，通过菌落 PCR 和测序确认敲除菌株。
- 蛋白质结晶和结构测定：通过悬滴气相扩散法在 20°C 培养 Tub 晶体，收集衍射数据并进行处理和分析。对于钨酸盐结合的 Tub 结构，使用单波长异常衍射（SAD）获得相位信息；对于无配体的 Tub 结构，使用分子置换（MR）法，最终对模型进行优化和完善，并将坐标和结构因子存入蛋白质数据库。
- 生物信息学分析：使用 InterPro DA 网络工具和 InterProScan、EggNOG mapper 对 UHGG 数据集中的蛋白进行分析，根据特定的 IPR 编号和 COG 编号筛选含 TOBE 结构域的蛋白及相关蛋白，并通过自定义 Perl 脚本和关系数据库进行数据解析和分析。
