视觉诱发行为背后的奥秘：斑马鱼揭示的感觉运动转换机制

本文利用斑马鱼幼体模型，开发了视觉诱发冻结范式（visually evoked freezing paradigm），结合多种行为范式和大规模成像技术，探究视觉信息如何转化为行为输出。研究发现了感觉神经元和感觉运动神经元（sensorimotor neurons）的分布，为理解视觉行为的神经机制提供重要线索。

　　### 研究背景
动物依靠视觉系统探测目标并做出行为反应，不同视觉刺激会引发特定行为，如猎物刺激触发捕食行为，捕食者样刺激引发战斗、逃跑或冻结反应。其中，冻结是动物在感知潜在威胁时的一种本能反应，表现为停止运动和心率下降，有助于躲避捕食者的察觉。在许多生物中，简单视觉刺激就能诱发这些行为，比如小的移动物体代表猎物触发捕食行为，而逐渐靠近的刺激（looming stimuli）代表逼近的捕食者触发逃避行为。然而，视觉信息如何转化为适当行为输出的具体机制，尤其是在脊椎动物中，仍不清楚。

视顶盖（optic tectum，哺乳动物中为上丘 superior colliculus）因接收视网膜输入、包含视觉空间地图且与运动区域相连，被认为是视觉运动转换的关键部位，但其他脑区也参与这些行为，且难以全面记录这些区域在行为过程中的活动，以观察动物如何决定是否做出反应以及选择何种行为。

实验设计

本研究以斑马鱼幼体为研究对象，设计了一种视觉诱发冻结范式。通过向其呈现不同类型的视觉刺激，包括模拟捕食者的移动暗盘（sweeping dark disk）、猎物刺激（小的移动 UV 点）和逼近刺激（looming stimulus，暗盘从 6° 扩大到 60°），观察斑马鱼幼体的行为反应，并利用 2p 钙成像技术（2p calcium imaging）对其大脑进行成像，以识别与不同刺激和行为相关的神经元。

实验中，将受精后 6 - 7 天的斑马鱼幼体头部固定，距离屏幕 1cm，用高速摄像机从上方和侧面监测其行为。同时，使用表达核定位的 GCaMP6s 的斑马鱼幼体（elavl3:Hsa.H2B - GCaMP6s），通过电可调透镜对大脑进行大体积成像，记录 14 个平面、2Hz 的成像数据，覆盖约 2/3 的大脑体积。

实验结果

1. 大平移圆盘导致不动：向斑马鱼幼体呈现 15° 的暗盘在红色背景上水平扫过的刺激，发现该刺激能抑制幼体的自发游泳，使其在数秒内保持不动。量化分析显示，刺激呈现期间游泳概率显著降低，表明该刺激可引发不动行为，这是冻结行为的一个特征。
2. 心动过缓可作为冻结的指标：在许多物种中，冻结常伴随着心率下降。研究发现，斑马鱼幼体在接受暗盘扫过刺激时，心率也会显著降低，且心动过缓与运动减少相关。因此，在后续实验中，将心动过缓作为冻结行为的行为读数。
3. 诱导心动过缓的最佳刺激参数：研究不同背景颜色、刺激速度和直径对诱导心动过缓的影响，发现暗盘在红色、UV 和绿色背景上均能有效触发心动过缓，而亮盘在暗背景上效果较差。综合考虑，选择暗盘在红色背景上、速度为 60°/s、直径为 15° 的刺激用于后续实验。
4. 功能成像识别对每种刺激做出反应的感觉神经元：为研究冻结通路以及它与捕食和逃避通路的差异，对冻结行为检测方法进行改进，用于体积 2p 钙成像，并增加猎物和逼近刺激。通过计算感觉指数（Sensory Index，SI）来识别感觉神经元，SI 反映神经元对重复刺激的响应周期性。结果发现，大部分感觉神经元位于视顶盖，猎物刺激还激活了大量顶盖前区的神经元。不同类型的感觉神经元对不同刺激的反应存在差异，部分神经元对多种刺激有反应，表明视顶盖感觉神经元可能更特异性地编码物体位置而非物体身份。
5. 识别与每种行为相关的感觉运动神经元：动物对相同视觉刺激的行为反应并不完全相同，在视觉运动通路中，视觉信息必然与其他信息整合以做出行为决策。通过设计一种分析方法，将神经元反应分解为刺激依赖和独立的成分，计算运动剩余指数（Motor Surplus Index，MSI）来识别感觉运动神经元（sensorimotor neurons，SM neurons）。结果确定了不同行为相关的 SM 神经元群体，它们在行为试验中反应更强烈，且与感觉神经元群体几乎完全不同。SM 神经元在不同脑区的分布存在差异，在视顶盖、丘脑和峡核（Nucleus Isthmi，NI）等区域均有分布，且不同行为的 SM 神经元在这些区域的分布模式不同。
6. 视顶盖感觉运动神经元的解剖和功能：视顶盖是感觉神经元集中的区域，也包含与三种行为相关的 SM 神经元。不同行为的 SM 神经元在视顶盖的不同区域分布，如捕食 SM 神经元位于最前部，冻结 SM 神经元位于中间，逃避 SM 神经元位于最后部。通过光遗传刺激实验，发现刺激视顶盖的前部和后部可分别引发更多的眼睛会聚和逃避反应，表明这些区域的 SM 神经元可能介导相应的行为反应。进一步研究发现，感觉神经元和 SM 神经元在视顶盖的位置存在一定关系，且部分冻结和捕食 SM 神经元与相应的感觉神经元存在显著的部分相关性，支持感觉神经元为 SM 神经元提供输入的观点，但逃避 SM 神经元与相应感觉神经元的相关性较低。
7. 使用偏相关分析评估视顶盖内的连接性：为确定感觉神经元和 SM 神经元在视顶盖内是否连接，采用偏相关分析方法。通过计算去除行为相关活动后的残差活动轨迹的偏相关系数，发现大量冻结和捕食 SM 神经元与相应的感觉神经元存在显著的偏相关性，而逃避 SM 神经元与相应感觉神经元的显著偏相关性较少。同时，对其他脑区进行分析，发现丘脑和顶盖前区的 SM 神经元与相应感觉神经元的相关性较低，但顶盖前区的捕食 SM 神经元与视顶盖的捕食 SM 神经元存在显著相关性，表明这些区域的神经元可能存在连接和信息传递。
8. 视顶盖感觉运动神经元在一种行为中特异性反应：研究发现，视顶盖的 SM 神经元在功能上具有特异性，平均而言，它们仅在其主要相关行为中做出反应。例如，捕食、冻结和逃避 SM 神经元群体分别在捕食、冻结和逃避行为试验中表现出较高的活性，且不同行为的 SM 神经元群体之间的重叠较少。此外，视顶盖的猎物和扫掠感觉神经元群体在功能分布上高度重叠，但相应的捕食和冻结 SM 神经元群体的反应却存在差异，这表明感觉运动通路在视顶盖水平已经发生了分化。
9. 下游区域包含三种行为的感觉运动神经元：研究视顶盖下游区域的 SM 神经元分布，发现峡核、丘脑和背内侧 pallium（哺乳动物杏仁核的同源物）等区域均含有不同类型的 SM 神经元。在峡核中，逃避 SM 神经元位于后部；在丘脑中，冻结和逃避 SM 神经元集中在 medial thalamus；在背内侧 pallium 中，仅发现冻结和逃避 SM 神经元，未发现捕食 SM 神经元。这些结果表明，在视顶盖中分离的行为通路在下游区域继续保持分离，但在峡核和丘脑中存在部分神经元参与两种行为通路的情况。

研究讨论

本研究开发了一种适用于斑马鱼幼体视觉诱发冻结反应的成像兼容行为检测方法，并利用该方法和已有的捕食和逃避行为研究，绘制了视觉刺激检测和视觉行为选择的神经回路。视顶盖包含大量对三种视觉刺激做出反应的感觉神经元，这些神经元可能整合视网膜神经节细胞的输入，以响应视野中的移动物体。感觉神经元可能为相应行为的视顶盖 SM 神经元提供输入，SM 神经元也可能接收其他反映恐惧、饱腹感、运动状态或其他内部状态的输入。

虽然视顶盖的冻结和捕食 SM 神经元似乎接收感觉输入并与行为相关，但不能确定它们就是做出冻结或捕食决策的部位，因为它们可能还接收来自其他实际做出决策的区域的输入。此外，视顶盖可能不是 SM 神经元接收感觉输入的唯一部位，顶盖前区的捕食 SM 神经元也与猎物感觉神经元相关，可能参与猎物识别和行为启动。同时，视顶盖的冻结 SM 神经元也可能接收来自丘脑等其他区域的输入，行为决策可能在其他区域做出，然后传递到视顶盖的 SM 神经元。而且，目前尚不清楚 SM 神经元如何读取感觉神经元的活动，以及信息流动的方向和各区域在检测刺激和产生视觉行为中的具体功能，这些都需要进一步研究。

除视顶盖外，在丘脑、峡核和背内侧 pallium 等区域也发现了大量与三种行为相关的 SM 神经元，这与以往在斑马鱼和小鼠中的研究结果一致，表明这些重要的先天行为的神经回路在进化上可能是保守的。然而，这些区域在行为中的具体作用以及行为决策的位点仍有待确定。