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本文发现 SLC35B4 是甲型流感病毒（IAV）复制的重要宿主因子。它通过运输 UDP - 木糖促进 IAV 内化，影响 IAV 在小鼠体内的毒力。研究揭示了 SLC35B4 - XYLT2 - B4GALT7 - EXT1 - EXT2 - AGRN - AP2B1 轴，为抗 IAV 疗法开发提供新思路。
引言
甲型流感病毒（IAV）是一种有包膜的单链负义 RNA 病毒，对人类和动物健康构成重大威胁。IAV 的复制高度依赖宿主细胞机制，其感染起始于病毒血凝素（HA）与细胞表面唾液酸（SA）受体结合，引发受体介导的内吞作用。此前研究通过全基因组 siRNA 文库筛选发现，人类溶质载体基因 SLC35B4 可能是 H5N1 病毒复制的正调控因子，但 O - 糖（如 O - GlcNAc 和 O - 木糖）在 IAV 内吞中的作用尚不清楚，本研究旨在探究 SLC35B4 及相关因子在 IAV 感染中的作用机制。
结果
- SLC35B4 对不同亚型 IAV 复制的重要性：通过全基因组 siRNA 文库筛选，发现 SLC35B4 mRNA 下调显著降低 H5N1 NA - Venus 病毒在 A549 细胞中的荧光强度，且不影响细胞活力。多种野生型 IAV（如 WSN（H1N1）、SH13（H9N2）、AH05（H5N1）、FZ09（H1N1））在 SLC35B4 敲低或敲除的 A549 细胞中病毒滴度明显下降，同时 SLC35B4 敲低也影响 VSV - EGFP 病毒生长，表明 SLC35B4 是具有广谱促病毒活性的宿主因子，且其对 IAV 复制的正向调控不影响宿主先天免疫。
- SLC35B4 对 IAV 在小鼠体内毒力的重要性：由于纯合 Slc35b4 基因敲除（KO）小鼠胚胎致死，通过使用修饰的 siRNA 敲低小鼠体内 Slc35b4 蛋白表达（Slc35b4_KD）。结果显示，Slc35b4_KD 小鼠感染 WSN（H1N1）病毒后，存活率提高，体重下降幅度小于对照组，表明 SLC35B4 表达降低限制了 IAV 的致病性。
- SLC35B4 参与 IAV 复制周期的早期阶段：SLC35B4 敲除导致 IAV 感染早期，病毒 RNA 转录本和蛋白质表达水平降低，病毒核蛋白（NP）在细胞核内的积累减少，病毒复制周期进程受限。但在 HEK293T 细胞中，SLC35B4 敲除不影响病毒核糖核蛋白（vRNP）的活性，且 SLC35B4 与 vRNP 蛋白无直接相互作用，说明其不参与病毒基因组的转录或复制。
- SLC35B4 对 IAV 内化的重要性：SLC35B4 不与病毒包膜蛋白（HA、NA、M2）和基质蛋白（M1）直接相互作用，且其敲除不影响细胞表面 SA 的表达和 IAV 的附着，但显著损害 IAV 的内化过程。酸性磷酸缓冲液（PBS）洗涤实验、共聚焦显微镜分析和酸旁路实验均证实了这一点，且 SLC35B4 敲除对细胞总吞噬作用无影响，表明其特异性调节 IAV 的内化。
- SLC35B4 敲除对病毒融合 / 脱壳的影响：SLC35B4 缺陷导致 IAV 内化受损，进而影响病毒融合 / 脱壳过程。在 SLC35B4 敲除的 A549 细胞中，病毒融合 / 脱壳表型明显减弱，但 SLC35B4 不参与内体酸性化过程。
- SLC35B4 不依赖 UDP - GlcNAc 转运功能介导 IAV 内吞：SLC35B4 分布于内质网（ER）和高尔基体，虽已知其运输细胞质 UDP - GlcNAc 用于糖基化修饰，但研究发现其不能介导 Notch1、Notch2、FFAR2 和 IGDCC4 的 O - GlcNAc 修饰，且 EOGT 敲低或敲除不影响 WSN（H1N1）病毒复制，表明 SLC35B4/EOGT 的 UDP - GlcNAc 转运 / 转移酶功能与 IAV 内吞无关。
- SLC35B4 介导的 UDP - 木糖运输对 IAV 复制的重要性：SLC35B4 参与 UDP - 木糖的运输，ER 驻留的 XYLT2 利用 UDP - 木糖启动蛋白聚糖中糖胺聚糖（GAG）链的生物合成。敲低 XYLT2、B4GALT7、EXT1 或 EXT2 均显著降低 WSN（H1N1）病毒的生长滴度，且这些基因与 SLC35B4 存在共定位，表明木糖利用相关因子参与 IAV 复制的调控。
- AGRN 对 IAV 内化的重要性：在多种硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPGs）中，只有 AGRN 敲低显著降低多种亚型 IAV（如 WSN（H1N1）、SH13（H9N2）、AH05（H5N1）、FZ09（H1N1））的感染性病毒产生。AGRN 敲除不影响细胞表面 SA 表达和病毒附着，但显著抑制 IAV 内吞，表明 AGRN 是 IAV 高效内化的关键细胞因子。
- AGRN 与 IAV HA 蛋白的相互作用区域：AGRN 与 IAV 的 HA 蛋白存在明显相互作用，HA1 结构域负责与 AGRN 结合。进一步研究发现，AGRN 的 30 - 350 和 1325 - 1548 区域与 HA1 结构域有强结合作用，且这种相互作用不依赖 SA，并且 AGRN 能与不同亚型 IAV 的 HA1 结构域相互作用。
- SLC35B4 介导的 AGRN 的 HS 修饰对 IAV 内化的影响：肝素酶处理不影响 IAV 感染，表明 SLC35B4 介导的 HS 修饰不直接影响 IAV 附着。AGRN 是 HS 修饰的底物，其 HS 修饰影响自身表达和周转，但不影响分泌。AGRN 与内吞适配器 AP2B1 相互作用，SLC35B4 缺陷导致 AGRN HS 突变体积累，通过蛋白酶体途径降解 AP2B1，从而抑制 IAV 内吞。
讨论
本研究通过多种实验方法，明确了 SLC35B4 在 IAV 复制中的重要作用。SLC35B4 通过运输 UDP - 木糖，参与 HS 修饰途径，影响 AGRN 的稳定性和 AP2B1 的表达，进而调控 IAV 的内吞过程。这一发现揭示了 IAV 内吞依赖于 SLC35B4 - XYLT2 - B4GALT7 - EXT1/EXT2 介导的 HS 修饰途径，而非 SLC35B4 - EOGT 介导的 O - GlcNAcylation 信号通路。研究结果为深入理解 IAV 感染机制提供了新视角，也为开发潜在的抗 IAV 疗法奠定了基础。未来研究可进一步探究该通路中其他潜在的调控靶点，以及如何通过干预该通路实现更有效的抗病毒治疗。
