基于Grm8基因座内peripherin启动子报告系统解析小鼠内耳神经元亚群发育分化的时空特征

本研究通过构建Prphp-mCherry转基因小鼠模型，结合纳米孔基因组测序和CUBIC/PEGASOS组织透明化技术，首次在三维空间尺度解析了内耳螺旋神经节(SGN)和前庭神经节(VGN)神经元亚群的发育动态。研究发现mCherry报告基因在Grm8基因座的特异性整合揭示了基底区(高频编码)以I型SGN为主的异质性群体，同时明确了前庭小直径"纽扣"神经元(bouton afferents)的分布特征，为听觉-平衡神经回路发育及耳科疾病机制研究提供了新工具。

　　

内耳作为听觉与平衡觉感知的核心器官，其神经编码的精确性依赖于螺旋神经节(SGN)和前庭神经节(VGN)神经元的高度异质性。尽管单细胞转录组学已初步揭示SGN存在Ia/Ib/Ic亚型，但传统技术难以在时空维度解析这些神经元亚群的发育轨迹。更关键的是，支配外毛细胞(OHC)的II型SGN（以peripherin为标志物）与支配内毛细胞(IHC)的I型SGN在听觉信息处理中的协同机制仍存争议，而前庭系统中小直径"纽扣"神经元(bouton afferents)的分布规律尚未明确。这些认知空白严重制约了噪声性耳聋、前庭功能障碍等疾病的机制研究。

澳大利亚新南威尔士大学Lily J. Pearson团队在《Scientific Reports》发表的研究中，创新性地构建了Prph_p-mCherry转基因小鼠模型。通过纳米孔测序发现报告基因意外整合于代谢型谷氨酸受体8基因(Grm8)位点，该基因恰为Ic型SGN的分子标记。研究团队采用CUBIC/PEGASOS组织透明化结合光片显微成像技术，首次实现了从出生后到成年期全内耳神经元的三维定量分析。

关键技术包括：1）纳米孔全基因组测序定位转基因整合位点；2）CUBIC/PEGASOS组织透明化处理实现完整内耳成像；3）光片显微镜三维重建技术定量神经元亚群；4）免疫荧光共标验证神经元身份；5）听觉脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)功能检测。

Prph_p-mCherry转基因在Grm8基因座的整合特征
纳米孔测序揭示该转基因以头尾相连方式插入Grm8外显子区，导致Venus捕蝇草结构域(VFT)关键谷氨酸结合位点破坏。AlphaFold2蛋白预测显示突变体丧失N端功能域，表明该品系实质为Grm8功能缺失型。

成年内耳mCherry⁺神经元的空间分布
三维成像显示mCherry⁺ SGN在耳蜗基底区（高频编码的"钩区"）密度最高，呈梯度递减至中部。意外的是，除peripherin⁺的II型SGN外，大部分标记神经元为支配IHC的I型SGN。前庭系统中，mCherry⁺神经元占VGN总量的15%，均匀分布于上下核团，符合小直径"纽扣"神经元特征。

发育期神经元亚群的动态变化
出生后14天(P14) mCherry⁺ SGN达峰值(1068个)，其中与peripherin共标的II型SGN仅占22%。成年后钩区mCherry⁺神经元比例从P1的92%降至42%，反映I型SGN亚群的特化。VGN中mCherry⁺神经元比例从P1的80%锐减至成年的14%，伴随细胞尺寸减小，提示发育筛选过程。

听觉功能表征
Prph_p-mCherry小鼠在24kHz呈现ABR阈值升高(7.5dB)，但DPOAE正常，表明Grm8缺失可能特异性影响高频区Ic型SGN功能，而非外毛细胞机械转换。

这项研究通过创新的转基因模型与三维成像技术，首次在时空维度解析了内耳神经元亚群的发育规律。Grm8位点意外整合使该模型兼具peripherin启动子活性和Ic型SGN标记的双重特性，为听觉-前庭系统研究提供了独特工具。发现基底区I型SGN优势群体可能解释高频听力易损性，而前庭小神经元发育轨迹为平衡障碍研究开辟新视角。该工作不仅深化了对神经编码多样性的理解，更为耳科疾病精准干预提供了潜在靶点。