硫化氢代谢新突破：Acidithiobacillus ferrooxidans中 SQR 基因的奥秘与应用前景

在微生物硫代谢领域，Acidithiobacillus ferrooxidans备受关注。本文通过克隆并过表达该菌的两个硫化物醌还原酶（SQR）基因 AFE_0267 和 AFE_1792，发现它们均具 SQR 活性，且过表达可增强细胞生长、硫氧化及矿物浸出效率，为生物技术发展提供新思路。

　　

硫化氢代谢研究背景

硫在自然界中具有多种氧化态，其化合物在微生物代谢过程中扮演着重要角色。硫还原微生物能产生硫化氢（H₂S），而硫氧化微生物则在废水处理、脱硫以及金属生物浸出等方面有广泛应用。Acidithiobacillus ferrooxidans作为一种典型的生物浸出微生物，可氧化铁或硫，在有氧或无氧条件下均能生长。但其硫氧化途径复杂，涉及多种还原态硫中间化合物，具体机制仍有待深入研究。

H₂S 是硫氧化过程中的关键中间产物，A. ferrooxidans在硫氧化过程中会产生 H₂S，同时也能利用硫化物作为能源。细胞内的硫化物醌还原酶（SQR）可催化 H₂S 氧化，消除其毒性。在A. ferrooxidans中已鉴定出两个 SQR 基因，其中 AFE_1792 编码的 SQR 蛋白已被深入研究，而 AFE_0267 编码的蛋白虽被注释为潜在 SQR，但功能尚未明确。

实验设计与方法

1. 实验材料准备：选用A. ferrooxidans的模式菌株 ATCC 23270，准备多种培养基，包括 F2S、AFM1、SM4 等，用于不同实验阶段的细胞培养。培养基成分明确，且在使用前需过滤处理，硫在过滤后添加。实验所用化学试剂多购自 Sigma - Aldrich 公司，黄铁矿和磁黄铁矿用于生物浸出实验。
2. 基因操作流程：提取A. ferrooxidans的基因组 DNA，利用特定引物对 AFE_0267 和 AFE_1792 基因进行扩增，随后将扩增产物克隆到 pJRD215 载体中，构建重组质粒 pYI72 和 pYI73。重组质粒先转化到E. coli DH5α 中进行验证，再通过滤膜杂交法将其转移到A. ferrooxidans中，筛选出过表达 SQR 基因的菌株 AF72 和 AF73。
3. 实验条件设置：分别在有氧和无氧条件下进行硫氧化实验。有氧实验在 250 mL 锥形瓶中进行，无氧实验在 105 mL 血清瓶中进行，实验过程中定期监测硫酸盐浓度、pH 值和铁浓度的变化。同时，利用 UFLC 系统分析硫氧化过程中硫中间产物的变化，通过数字聚合酶链反应（dPCR）检测相关基因的表达水平。生物浸出实验选用 AF73 和野生型细胞，以黄铁矿和磁黄铁矿为底物，监测浸出液中可溶性铁浓度来评估生物浸出效率。

实验结果

1. 硫氧化能力变化：在有氧条件下，过表达 AFE_1792 基因的 AF73 菌株比野生型和 AF72 菌株产生更多的硫酸盐，溶液最终 pH 值更低，表明 AFE_1792 基因过表达可增强有氧硫氧化能力。在无氧条件下，AF72 和 AF73 菌株的硫氧化和铁还原能力均优于野生型菌株，说明 AFE_0267 基因编码的蛋白在无氧条件下具有 SQR 活性。
2. 硫中间产物差异：不同菌株在有氧和无氧条件下，硫中间产物（如亚硫酸盐、硫代硫酸盐、多硫代硫酸盐等）的产生和消耗存在差异。有氧条件下，所有菌株中硫代硫酸盐含量最高，但 AF73 菌株的硫代硫酸盐随时间显著减少。无氧条件下，野生型菌株的多数硫中间产物浓度较低，而工程菌株积累了更多的亚硫酸盐和六硫代硫酸盐。
3. 基因表达差异：不同菌株在有氧和无氧条件下，参与硫代谢的基因表达存在差异。部分基因在野生型菌株中表达较高，而工程菌株中与硫氧化、硫载体和电子转移相关的基因表达增加。在有氧条件下，AF73 菌株中部分基因上调；在无氧条件下，AF72 和 AF73 菌株的基因表达模式更相似。
4. 生物浸出效率提升：过表达 AFE_1792 基因的 AF73 菌株对黄铁矿和磁黄铁矿的生物浸出效率显著高于野生型菌株，分别提高了 1.3 倍和 2.2 倍，说明增强的硫氧化能力有助于更好地溶解铁硫化物。

研究结论与意义

研究表明，A. ferrooxidans的 AFE_0267 和 AFE_1792 基因均编码具有不同功能活性的 SQR。AFE_1792 编码的 SQR 在有氧和无氧条件下均有活性，而 AFE_0267 编码的 SQR 仅在无氧条件下发挥作用。SQR 过表达可增强A. ferrooxidans的硫氧化能力，促进细胞生长，这可能是因为 SQR 活性增强降低了 H₂S 的毒性，并通过 H₂S 氧化提供了额外能量。

在硫氧化机制方面，有氧和无氧条件下存在不同的代谢途径。有氧时，异二硫键还原酶（HDR）途径在谷胱甘肽过硫化物（GSSH）氧化中起主导作用；无氧时，硫氧化途径主要由硫双加氧酶（SDO）氧化 GSSH 产生亚硫酸盐，进而氧化为硫酸盐。

SQR 过表达对黄铁矿和磁黄铁矿的氧化效率提升具有重要意义。黄铁矿氧化通过硫代硫酸盐机制，SQR 过表达增强了整体硫代谢，提高了浸出效率。磁黄铁矿在氧化过程中产生 H₂S，SQR 过表达不仅增强了对 H₂S 的氧化，还提高了对元素硫和中间硫物种的氧化速率。鉴于磁黄铁矿与多种金属矿相关，且在金属回收和环境方面存在问题，基因工程改造的生物浸出菌株有望为关键金属生产提供更有效的生物方法，在生物技术领域具有广阔的应用前景。