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这篇研究开发了一种基于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI TOF-MS）的方法，能快速预测铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）中碳青霉烯酶的存在，为合理使用亚胺培南 / 瑞来巴坦（imipenem/relebactam）治疗感染提供依据，对临床精准用药意义重大。
### 铜绿假单胞菌感染现状与治疗困境
铜绿假单胞菌（
P. aeruginosa）是一种主要的医院感染病原体，常引发多药耐药（MDR）和广泛耐药（XDR）感染，尤其在免疫功能低下或危重症患者中，导致较高的发病率和死亡率。其耐药性源于染色体编码的耐药机制，如
ampC上调、外膜孔蛋白 OprD 失活和外排泵作用，以及水平获得的广谱耐药元件，如超广谱 β- 内酰胺酶（ESBLs）和碳青霉烯酶。尽管新型头孢菌素 /β- 内酰胺酶抑制剂组合的出现部分缓解了治疗压力，但耐药问题仍日益严重，因此急需新的抗菌药物。
亚胺培南 / 瑞来巴坦的作用机制与应用前景
亚胺培南 / 瑞来巴坦是一种新型碳青霉烯 /β- 内酰胺酶抑制剂组合，在两项随机临床试验（RESTORE-IMI 1 和 RESTORE-IMI 2）中显示出对 MDR 革兰阴性菌感染（包括铜绿假单胞菌）的疗效。亚胺培南具有强大的抗铜绿假单胞菌活性，不易被固有 AmpC 裂解且不易被多数 RND 型外排系统识别，瑞来巴坦则能有效抑制 A 类和 C 类 β- 内酰胺酶，增强亚胺培南的抗菌效果。不过，金属 β- 内酰胺酶和 D 类碳青霉烯酶不能被瑞来巴坦抑制。
基于 MALDI TOF-MS 的检测方法开发
- 算法设计原理：该算法基于亚胺培南 / 瑞来巴坦对铜绿假单胞菌的作用机制，考虑了亚胺培南的水解特性、瑞来巴坦对 AmpC 的抑制作用以及对不同碳青霉烯酶的影响。通过平行分析亚胺培南和亚胺培南 / 瑞来巴坦的水解谱，依据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）指南，预测碳青霉烯酶的存在及 β- 内酰胺耐药机制。
- 细菌分离株：
- 训练集：包括 169 株铜绿假单胞菌分离株，涵盖 PAO1 衍生突变株、表达 β- 内酰胺酶基因的 PAO1 衍生菌株以及临床多药耐药 / 广泛耐药（MDR/XDR）全基因组测序（WGS）特征菌株，这些菌株代表了多种 β- 内酰胺耐药机制。
- 验证集：250 株前瞻性随机收集的临床菌株，用于在临床环境中验证算法性能，研究人员在进行 MALDI TOF-MS 光谱分析时对亚胺培南和亚胺培南 / 瑞来巴坦的最低抑菌浓度（MIC）数据不知情。
- 实验方法：
- WGS 和耐药组分析：对细菌分离株进行 WGS，使用 Illumina 平台测序，Unicycler 软件组装，通过相关工具鉴定获得性抗菌耐药基因和 β- 内酰胺耐药突变机制。
- 抗菌药物敏感性测试：采用肉汤微量稀释法测定亚胺培南和亚胺培南 / 瑞来巴坦的 MIC，以 EUCAST v 14.0 临床折点为主要参考，CLSI（M100 Ed34）标准为对照。
- MALDI TOF-MS 检测：将细菌与亚胺培南及不同浓度瑞来巴坦孵育，离心后取上清进行 MALDI TOF-MS 分析，以 PAO1 为阴性对照，PAO1 表达blaVIM-1基因菌株为阳性对照，整个过程在 1 小时内完成。
- 数据处理与解读：利用 Clover MS 数据分析软件（Clover MSDAS）计算亚胺培南水解率（RH），根据 RH 值判断亚胺培南水解情况，进而推断碳青霉烯酶的存在和耐药机制。
检测方法的性能评估
- 优化与性能测试：确定 1mg/L 为瑞来巴坦的最佳浓度，通过受试者工作特征（ROC）曲线和尤登指数确定内部检测的最佳水解截断值，RH≥0.5 为阳性，<0.2 为阴性。
- 临床前评估：
- 实验室菌株评估：对 PAO1 衍生物突变驱动耐药菌株，该方法成功预测非碳青霉烯酶产生和亚胺培南 / 瑞来巴坦敏感性，准确率达 100%。对表达主要 β- 内酰胺酶的转化体，能有效区分碳青霉烯酶产生菌株和非产生菌株，但对 GES-5 和 GES-20 碳青霉烯酶存在检测困难。
- 临床分离株评估：在 121 株 MDR/XDR 临床菌株中，该方法检测碳青霉烯酶的准确率为 80%，对 GES 产生菌株检测存在误差，整体预测亚胺培南 / 瑞来巴坦敏感性的准确率为 81%，误差主要与 GES 产生菌株及突变耐药菌株有关。
- 临床验证：在 250 株前瞻性收集的临床菌株中，检测碳青霉烯酶的准确率为 100%，整体预测亚胺培南 / 瑞来巴坦耐药的准确率为 70%，预测敏感性的总体符合率为 98%。根据 EUCAST 和 CLSI 指南评估误差，CLSI 指南可降低误差分类的严重程度。
讨论
本研究开发的基于 MALDI TOF-MS 的方法能为铜绿假单胞菌碳青霉烯耐药机制提供初步信息，有助于指导亚胺培南 / 瑞来巴坦的合理使用。该方法在训练集菌株中表现良好，但对 GES 产生菌株检测存在局限性，且在预测突变耐药菌株的敏感性时也有误差。不过，在实际临床场景中，该方法对金属 β- 内酰胺酶的检测准确率较高。此外，该方法具有操作简单、快速的优势，相比传统检测方法能在 1 小时内得出结果，为临床治疗铜绿假单胞菌感染提供了一种有价值的辅助工具，但在 GES 型碳青霉烯酶流行率高或存在染色体突变耐药菌株的情况下需谨慎使用。
