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疟疾（Malaria）和巴贝斯虫病（babesiosis）严重威胁健康。本文对比血液学薄涂片（HS）与寄生虫学厚、薄血涂片（PS），发现 HS 在低流行环境下诊断这两种疾病的敏感性达 93.3%、特异性达 99.8% ，是可靠诊断工具，对临床意义重大。
血液学薄涂片在疟疾和巴贝斯虫病诊断中的关键价值研究
疟疾（由疟原虫Plasmodium 属引起）和巴贝斯虫病（由巴贝斯虫Babesia 属引起）是两类重要的寄生虫感染性疾病。在美国，每年平均有 1773 例疟疾病例和 1762 例巴贝斯虫病例。若治疗不及时，会引发严重并发症，如疟疾的脑型疟、严重疟疾贫血、昏迷甚至死亡；巴贝斯虫病的血小板减少、肾衰竭和急性呼吸窘迫综合征，尤其是免疫功能低下或无脾的患者。因此，及时准确的诊断对疾病治疗至关重要。
传统上，寄生虫学厚、薄血涂片（PS）是诊断疟原虫和巴贝斯虫感染的金标准。但该方法存在局限性，手工计算血液涂片中的寄生虫水平既费力，又需专业训练有素的人员操作。而且，其技术复杂，受显微镜质量和染色材料等因素影响，易导致诊断错误。基于此，本研究旨在比较血液学薄涂片（HS）和 PS，评估 HS 在检测疟原虫和巴贝斯虫感染中的性能，为临床诊断提供更有效的方法。
材料和方法
- 病例选择和图表审查：回顾性审查 2018 年 1 月至 2023 年 10 月期间，在威斯康星大学健康中心（UW Health）进行 HS 检测，同时在威斯康星州卫生实验室（WSLH）进行 PS 检测的患者病例。仅纳入 HS 和 PS 检测使用同一血液标本的病例，并确定治疗相关详细信息。
- 玻片制备：用 EDTA 管采集外周全血，1 小时内制备涂片。使用 HemaPrep 自动血液涂片仪制备 4 张薄涂片，每张长 1 - 1.5 英寸，有羽毛状边缘；用移液管取一滴 EDTA 血，在载玻片中心以圆形方式涂抹，制作 2 张厚涂片，合适密度的厚涂片放在湿的新闻纸上，文字应勉强可见。涂片完全风干后进行染色，2 张薄涂片用于 HS 检测，另外 2 张薄涂片和 2 张厚涂片不染色，送往 WSLH 进行确认检测。
- 血液学薄涂片检测：用 Colorwright Wright - Giemsa 染色剂和 Sysmex SAS - 100 缓冲液（pH 6.8）在 Sysmex SP - 10 自动染色仪上对 2 张薄涂片染色。评估染色质量，确保能清晰区分紫色核物质和粉红色红细胞（RBCs）且无沉淀。染色不合格则重新制备和染色。由两名普通技术人员使用明场显微镜，在 ×10、×20、×50 物镜下筛查大型寄生虫，×100 物镜下筛查红细胞内寄生虫。每张薄涂片在 ×100 物镜下检查 300 个油镜视野。若未发现寄生虫，报告为 “未发现血液寄生虫”；若发现，则报告 “存在疟原虫或巴贝斯虫” 及寄生虫血症百分比（四舍五入到最接近的整数）。HS 涂片全天及每周 7 天都进行读取和报告结果。
- 血液学薄涂片寄生虫血症百分比测定：使用尼康明场显微镜和尼康米勒盘标线片测定寄生虫血症百分比。将一个目镜更换为米勒盘标线片，其包含一大一小两个正方形，大正方形面积是小正方形的 9 倍。在 ×100 物镜下，选择约一半红细胞相互接触的视野，计数 1000 个红细胞内的寄生红细胞数。先数小正方形内的所有红细胞，再数大小正方形内的寄生红细胞，一个红细胞内多个寄生虫计为一个。计数时，位于小正方形顶部和左侧边界线上的红细胞计入，右侧和底部边界线上的不计入。重复该过程，直到小正方形内红细胞总数至少达到 112 个（对应大正方形内 1000 个红细胞）。按公式（大正方形内寄生红细胞数 ×100）÷（小正方形内红细胞总数 ×9）计算寄生虫血症百分比，对第二张涂片重复操作。两张涂片的寄生虫血症结果需在两个百分点内相符，取平均值并四舍五入到最接近的整数。若寄生虫血症低于 1%，报告为 “<1%”。另外的涂片和血液送 WSLH 确认寄生虫存在，并通过显微镜检查和聚合酶链反应（PCR）检测进一步鉴定属和种。
- 寄生虫学厚、薄血涂片检测：WSLH 收到的 2 张薄涂片用无水甲醇固定，2 张厚涂片不固定。所有涂片风干后，用 2.5% 吉姆萨染色剂染色 45 分钟。薄涂片在缓冲水中浸 1 - 2 次清洗，厚涂片在缓冲水中放置 3 - 5 分钟，然后均风干。由专门训练的寄生虫学技术人员用显微镜在 ×10、×20、×100 物镜下读取涂片，寻找大小寄生虫。薄涂片在 ×100 物镜下至少检查 300 个视野。通过计数感染红细胞数，除以平均每个视野的红细胞数和读取的总视野数，计算寄生虫血症百分比，精确到千分之一。使用实验室开发的 PCR 方法确认并鉴定到物种水平。WSLH 报告中不区分 PS 厚涂片和薄涂片结果，将同一标本的 PS 厚、薄涂片结果视为一个整体。PS 涂片仅在工作日工作时间读取和报告结果，标本需在工作日送往 WSLH。
结果
本研究共分析了 335 例独特患者，这些患者的初始诊断和随访检测共产生 529 个 HS 和 PS 检测配对样本。其中，483 例（91%）为 PS 阴性 / HS 阴性，42 例（8%）为 PS 阳性 / HS 阳性，3 例（1%）为 PS 阳性 / HS 阴性，1 例（<1%）为 PS 阴性 / HS 阳性。4 例不一致的病例均为已知诊断后的随访监测，寄生虫血症值均低于定量水平。以 PS 为参考标准，HS 的敏感性为 93.3%（42/45），特异性为 99.8%（483/484），阳性预测值为 97.7%（42/43），阴性预测值为 99.4%（483/486）。在 42 例 PS 阳性 / HS 阳性病例中，鉴定出 21 例疟原虫感染和 21 例巴贝斯虫感染。PS 报告的寄生虫血症第 1 四分位数、中位数（平均值）和第 3 四分位数分别为 0.02%、0.1%（平均值 1.2%）和 1.1% ；HS 报告的分别为 < 1%、<1%（平均值 1.9%）和 2% 。PS 和 HS 的寄生虫血症值无显著差异（P = 0.2）。每个病例的两张 HS 涂片读数在两个百分点内相符，无需进一步仲裁。所有 PS 阳性或 HS 阳性患者均接受了治疗，对于初始诊断，在 HS 结果出来后、PS 评估前就给予治疗，体现了 HS 更快的周转时间的价值。
讨论
总体而言，在低流行环境下，HS 与 PS 的检测性能相似，具有较高的阳性和阴性预测值。在新诊断的疟原虫和巴贝斯虫感染病例中，HS 和 PS 的结果 100% 一致。PS 和 HS 出现假阴性结果的情况很少见，仅在已接受治疗的既往诊断患者的随访检测标本中出现，且寄生虫血症水平极低。阳性病例中，两种方法报告的寄生虫血症值相当，无显著差异。
本研究结果对临床实践具有重要意义，尤其是在缺乏能熟练解读 PS 涂片的专业人员的情况下。而且，技术人员的适当培训和监督对保证 HS 检测的敏感性至关重要，缺乏相关培训和监督会降低检测准确性。HS 的高敏感性和特异性表明，在低流行环境下，它可作为检测疟原虫和巴贝斯虫感染的有效诊断筛查工具，在等待确认检测结果时，能加快寄生虫感染的诊断和治疗。这对已进行 HS 检测但缺乏解读 PS 涂片或维持快速诊断测试（RDT）资源的小型医院和诊所非常有益。虽然 HS 仅报告 “存在疟原虫或巴贝斯虫” 且寄生虫血症百分比四舍五入到整数，但临床医生可结合临床评估和流行病学情况选择经验性治疗方案，鉴于总体寄生虫血症水平较低，这种方案对患者群体是合适的。此外，HS 的应用还可减轻专业实验室（如 WSLH）的负担，这些实验室虽具备解读 PS 涂片和进行 PCR 检测的专业知识，但可能无法快速提供检测结果。
疟原虫和巴贝斯虫的诊断方法多样，包括 PS、HS、RDT 和 PCR。显微镜检查厚、薄血涂片是传统方法，至今仍在全球广泛应用。厚涂片因血液浓度高，检测寄生虫更敏感，但解读难度较大；薄涂片有助于鉴定寄生虫种类和量化感染程度，但敏感性较低。一般来说，PS 的敏感性为 85% - 90%，特异性为 99.5% - 100%，具体数值取决于检查人员的培训和专业知识。此前对薄涂片与厚涂片的评估差异较大，薄涂片敏感性在 54.8% - 96.2% 之间，特异性在 92.6% - 100% 之间。本研究中，血液学实验室普通技术人员进行的 HS 检测，敏感性达到 93.3%，特异性达到 99.8%，性能与 PS 相当，且周转时间更快。HS 不仅可检测寄生虫，还能识别血细胞的形态异常，是一种经济实惠且更易获得的诊断工具。
RDT 的优势是能快速得出结果，对患者管理很重要，且无需显微镜检查专业人员操作，在资源有限的环境中特别有用；但其敏感性可能低于显微镜检查，且无法确定寄生虫种类或密度。RDT 的敏感性和特异性分别约为 97% 和 96%，在缺乏解读 PS 和 HS 资源及专业人员的地区，RDT 仍是重要的诊断方法。不过，这些数值会因 RDT 制造商和检测的疟原虫种类不同而有所差异，如本研究中 HS 的敏感性（93.3%）在 BinaxNow RDT 报告的敏感性范围内（92.9% - 99%，制造商声称疟原虫各物种平均敏感性为 97.7%）。对于恶性疟原虫Plasmodium falciparum ，RDT 的敏感性和特异性与上述数值较为一致，但对于间日疟原虫Plasmodium vivax 和卵形疟原虫Plasmodium ovale ，RDT 敏感性可低至 66% - 88% 和 86% 。因此，多数情况下，PS 或 HS 仍是更优选择。
PCR 检测的敏感性和特异性接近 100%，是检测寄生虫感染最准确的方法，尤其在确认物种和检测耐药性方面具有优势，能检测到低至 2 - 5 个寄生虫 /μL 的寄生虫血症，而 RDT 能检测到 100 个寄生虫 /μL，HS 和 PS 能检测到 50 - 500 个寄生虫 /μL 。然而，由于 PCR 需要复杂的设备、试剂维护，且要求操作人员具备高素质，该方法并不容易获得，标本常需送往专业实验室检测，不像 RDT 和 HS 那样在临床环境中易于开展。
本研究表明，HS 在诊断疟原虫和巴贝斯虫感染方面与 PS 性能相当，在低流行环境下是一种可行的替代诊断方法。HS 的高敏感性、特异性以及与 PS 结果的高度一致性，使其成为一种高效可靠的诊断工具，尤其适用于 PS、RDT 和 PCR 无法应用的情况。不过，本研究存在一定局限性，阳性病例数量相对较少（n = 46），未来还需更大样本量的研究来验证这些结果。
