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本文研究了不同品牌的 Mueller–Hinton 琼脂（MHA）对头孢地尔纸片扩散法（DD）药敏试验结果的影响。研究发现，使用商业 MHA 进行 DD 试验时，结果差异较大，尤其是对肉汤微量稀释法（BMD）判定为不敏感的菌株。这提示需重新审视相关方法和质量控制，以确保 DD 试验的可靠性。
引言
头孢地尔（Cefiderocol）是治疗多药耐药（MDR）革兰阴性（GN）细菌感染的有前景药物。其独特结构包含头孢菌素和铁载体，利用细菌铁转运系统进入细胞，克服部分耐药机制，被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于特定感染治疗。
然而，头孢地尔的抗菌药敏试验（AST）面临挑战。其作用机制依赖铁环境，在体外进行 AST 时，肉汤微量稀释法（BMD）和纸片扩散法（DD）都受影响。BMD 虽有铁耗尽培养基的使用指南，但方法不完善且不实用；DD 常用商业 Mueller–Hinton 琼脂（MHA），虽认为其铁结合状态可模拟铁耗尽环境，但不同品牌 MHA 的铁含量可能不同，导致试验结果差异。此外，临床和实验室标准协会（CLSI）、欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）和 FDA 的头孢地尔临床折点不同，也造成药敏解释不一致。由于临床失败和耐药性出现与头孢地尔使用相关，准确可靠的 AST 对指导治疗决策至关重要。本研究旨在探究 MHA 品牌对 MDR GN 细菌分离株 DD 结果解释的影响，并评估与 BMD 结果的一致性。
材料和方法
- 细菌分离株：选用 50 株 GN 细菌分离株，包括 47 株来自临床废弃样本的 MDR 菌株和 3 株来自抗生素耐药库的菌株，储存于 - 80°C。
- 肉汤微量稀释法：按照 CLSI 指南，用含头孢地尔的平板和铁耗尽的阳离子调节 Mueller–Hinton 肉汤（ID CAMHB）进行 BMD 试验。验证培养基铁浓度低于 0.03mg/L，制备 0.5 麦氏标准菌悬液并稀释，与不同浓度头孢地尔溶液混合，设置质量控制（QC）、阴性对照和生长对照。35°C 孵育 16 - 20 小时后，根据 CLSI 指南读取结果。清晰终点的最低抑菌浓度（MIC）记录为无生长的最低头孢地尔浓度；拖尾终点（多个孔有微弱生长）的 MIC 记录为生长抑制至特定程度的最低浓度。计算每个分离株的模态 MIC，并根据 CLSI、EUCAST 和 FDA 临床折点进行解释。
- 纸片扩散法：依据 CLSI 指南，用 30μg 头孢地尔纸片和 Remel、Hardy、BBL 三个品牌的 MHA 进行 DD 试验。对 E. coli ATCC 25922 和 Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 进行 QC。每个分离株在每个品牌的 3 个 MHA 平板上培养，不同菌株孵育时间不同。计算每个分离株在每个品牌平板上的平均抑菌圈直径，根据 CLSI、EUCAST 和 FDA 临床折点进行解释。若抑菌圈内有内部菌落，测量并报告无菌落区域大小。计算同一品牌内不同平板间的变异（ intra - brand variability）和不同品牌间抑菌圈直径的变异（inter - brand variability）。
- 一致性分析：将不同品牌 MHA 的 DD 平均抑菌圈直径的 CLSI 临床折点解释与 BMD 的模态 MIC（作为参考方法）进行比较，评估分类一致性（CA）、小误差（mE）、大误差（ME）和非常大误差（VME）。依据 CLSI 指南设定可接受阈值，即 CA≥90%，mE≤10%，ME 和 VME < 3%。
结果
- 细菌分离株：50 株分离株包括 20 株 Pseudomonas aeruginosa、18 株碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌（CRE，其中 9 株产碳青霉烯酶 CP - CRE，9 株非产碳青霉烯酶 non - CP - CRE）、6 株 Acinetobacter baumannii 复合物、4 株 Stenotrophomonas maltophilia 和 2 株 Burkholderia cepacia 复合物。
- 肉汤微量稀释法：成功对 48 株分离株进行 BMD 试验。在有头孢地尔临床折点的 46 株分离株（不包括 B. cepacia 复合物）中，多数体外敏感，少数为中介或耐药。多数分离株的 BMD 结果变异性低，14 株出现拖尾终点。
- 纸片扩散法：Remel MHA 上非肠杆菌科分离株的抑菌圈数据因 QC 失败未报告。8 株分离株出现内部菌落，主要在 BBL MHA 上。多数分离株的品牌内变异小，品牌间变异通常更大。BMD 判定为不敏感的菌株，其 DD 试验中不同品牌 MHA 的平均抑菌圈直径差异更大。部分 BMD 敏感菌株在 DD 试验中不敏感，部分 BMD 不敏感菌株在 DD 试验中敏感，不同品牌和折点标准下情况不同。
- 一致性分析：使用 CLSI、EUCAST 和 FDA 临床折点时，不同品牌 MHA 的 DD 与 BMD 的一致性表现不同。CLSI 折点下，BMD 敏感菌株的 CA 较高，但 BMD 不敏感菌株的 CA 较低；CRE 分离株的 CA 未达 90%，P. aeruginosa 分离株在部分品牌下 CA≥90%。EUCAST 折点下，部分品牌的 CA 未达 90%，且有较多 ME 和 VME。FDA 折点下，BMD 敏感菌株的 CA 较高，BMD 不敏感菌株的 CA 低，CRE 和 P. aeruginosa 分离株的 CA 也低于 90%。
讨论
本研究中，使用商业 MHA 进行 DD 试验与 BMD 相比，常出现 AST 解释差异。BMD 不敏感菌株在 DD 试验中易被误判为敏感，增加漏检耐药的风险。不同品牌 MHA 的 DD 结果差异大，影响实验室间结果的准确性和可重复性，尤其在 P. aeruginosa 和 CRE 分离株中。这可能与 MHA 中铁含量标准化不足和头孢地尔独特的细胞进入方式有关。
此前研究也发现 DD 试验在检测头孢地尔耐药性方面存在问题，建议对抑菌圈直径处于特定范围的菌株用 BMD 进行确认。除 DD 与 BMD 的差异外，BMD 本身也存在问题，如拖尾终点，这可能与培养基铁浓度和接种物差异有关。由于缺乏针对商业 DD MHA 的铁含量控制方法，开发相关质量控制或标准培养基很重要。
头孢地尔 DD 结果的不一致会影响对体内临床疗效的评估，进而影响临床决策和治疗结果。本研究存在局限性，样本量小且耐药菌株富集，部分现象同时出现的情况较少，存在读数变异性，且因 QC 失败无法评估部分非肠杆菌科细菌的 DD 结果。但研究结果仍表明，需进一步研究以确定准确实用的头孢地尔 AST 方法。
结论
临床急需标准化头孢地尔药敏试验，以确保方法准确且可重复。本研究中，DD AST 与 BMD 相比，在临床折点标准和商业 MHA 使用上存在解释差异，尤其在对头孢地尔不敏感的菌株、P. aeruginosa 和 non - CP - CRE 分离株中。虽样本有局限性，但研究结果提示需谨慎解释商业 MHA 的 DD 药敏结果，未来需探索更准确实用的 AST 方法。
