JC 多瘤病毒穿越血脑屏障的机制探索：对中枢神经系统感染的关键意义

本文聚焦 JC 多瘤病毒（JCPyV），它可引发进行性多灶性白质脑病（PML）。研究利用两种体外血脑屏障（BBB）模型，发现 BBB 内皮细胞虽不支持 JCPyV 感染，但能结合并内化病毒，且少量病毒可穿越屏障感染神经胶质细胞，为揭示 JCPyV 感染中枢神经系统机制提供关键依据。

　　

引言

JC 多瘤病毒（JCPyV）是一种广泛存在的双链 DNA 病毒，与进行性多灶性白质脑病（PML）的发生密切相关。PML 是一种致死性脱髓鞘疾病，在免疫功能低下或接受免疫调节治疗的患者中易发病，如 HIV-AIDS 患者和多发性硬化症患者。JCPyV 通常经粪口途径传播，在肾脏中建立持续无症状感染，随后可通过外周循环进入大脑，感染神经胶质细胞，引发 PML。

JCPyV 的感染过程涉及与 α2,6 - 唾液酸连接的聚糖乳糖系列四糖 c（LSTc）受体结合，随后依赖与 5 - 羟色胺 2 受体（5-HT2R）的相互作用，通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞。此外，JCPyV 还可与细胞外囊泡（EVs）结合，这种结合形式的病毒能独立于传统的病毒附着和进入受体感染细胞。有研究在 HIV?患者血清中检测到与 EVs 相关的 JCPyV 原型 DNA，提示 EVs 可能是 JCPyV 进入中枢神经系统（CNS）的载体。

为深入探究 JCPyV 的神经侵袭机制，本研究采用两种体外血脑屏障（BBB）内皮细胞模型：SV40/hTERT 永生化脑微血管内皮细胞系 hCMEC/D3 和诱导多能干细胞衍生的内皮细胞（iPSC-ECs）。hCMEC/D3 细胞常用于模拟 BBB 内皮细胞，而 iPSC-ECs 在过去十年中被开发，能更好地模拟 BBB 的功能特性，如 ABC 外排转运体极化、高跨内皮电阻（TEER）和对小分子荧光示踪剂的低通透性。

结果

1. hCMEC/D3 细胞和 iPSC-ECs 与 JCPyV 的相互作用：将 hCMEC/D3 细胞、iPSC-ECs 和 SVG-A 细胞（阳性感染对照）分别暴露于 JCPyV 或 JCPyV-EV，3 天后通过间接免疫荧光分析 VP1 表达来检测感染情况。结果显示，hCMEC/D3 细胞和 iPSC-ECs 未被感染，而 SVG-A 细胞呈阳性感染。通过凝集素（SNA）结合实验和流式细胞术分析发现，iPSC-ECs 与 SNA 的结合量与 SVG-A 细胞相似，hCMEC/D3 细胞结合量较少；hCMEC/D3 细胞与 Alexa Fluor 488 标记的 JCPyV 结合量显著低于 SVG-A 细胞和 iPSC-ECs，但三种细胞类型对标记 JCPyV 的内化量相似。用 II 型神经氨酸酶（NA）预处理细胞，可显著降低 JCPyV 的结合，表明 JCPyV 与细胞的结合依赖 α2,6 - 唾液酸。
2. hCMEC/D3 和 iPSC-EC 单层细胞屏障特性：iPS 细胞诱导为内皮细胞表型后，对其内皮细胞标记物表达和 p - 糖蛋白外排转运体极化进行严格表征。利用 Transwell 培养插入物构建 BBB 模型，发现 iPSC-EC 单层细胞的跨内皮电阻（TEER）显著高于 hCMEC/D3 单层细胞，且 iPSC-EC 屏障能限制低分子量钠荧光素（NA-F）示踪剂的通过，而 hCMEC/D3 细胞则不能。hCMEC/D3 单层细胞对一系列高分子量 FITC - 葡聚糖（4 - 70 kDa）具有半序限制作用，虽然其 TEER 值不如 iPSC-EC 培养物高，但 hCMEC/D3 在 Transwell 培养中仍被广泛用作血脑屏障的物理和功能模型。
3. JCPyV 通过 hCMEC/D3 和 iPSC-EC 单层细胞的情况：在 hCMEC/D3 单层细胞的 Transwell 模型中，将 JCPyV 病毒粒子或病毒相关细胞外囊泡（JCPyV-EVs）加入顶侧腔室，通过定量 PCR（qPCR）检测底侧腔室中病毒的积累。结果表明，hCMEC/D3 单层细胞在所有时间点都显著限制了病毒积累，与无细胞对照相比降低了几个数量级。检测 4 kDa FITC - 葡聚糖的通透性，发现持续暴露于 JCPyV 对 hCMEC/D3 单层细胞的屏障完整性无显著影响。用底侧上清液重新感染 SVG-A 细胞，发现其可建立最低限度但可检测到的感染。

在 iPSC-EC 单层细胞的 Transwell 模型中进行类似实验，结果显示 iPSC-ECs 也显著阻碍了病毒从顶侧到底侧腔室的通过。检测 TEER 和小分子示踪剂钠荧光素的穿透情况，发现暴露于病毒或病毒 - EV 对 iPSC-EC 单层细胞的 TEER 和钠荧光素穿透无显著影响。底侧上清液同样能在 SVG-A 细胞中建立可检测到的感染。

讨论

血脑屏障（BBB）是将大脑与外周循环分隔开的特殊多细胞界面，主要由内皮细胞、周细胞和星形胶质细胞终足组成，对维持中枢神经系统（CNS）的稳态至关重要。不同的嗜神经病毒采用不同策略穿越 BBB，如西尼罗河病毒在炎症状态下通过细胞旁途径穿越，寨卡病毒可通过跨细胞运输和感染脑微血管内皮细胞穿越。本研究表明，BBB 内皮细胞是 JCPyV 从外周循环进入大脑的潜在跨细胞通道。

hCMEC/D3 细胞和 iPSC-ECs 虽不支持 JCPyV 感染，但能结合并内化病毒，且结合依赖 α2,6 - 唾液酸。hCMEC/D3 和 iPSC-EC 单层细胞显著限制 JCPyV 的通过，但允许少量病毒积累在底侧腔室，这些病毒足以感染神经胶质细胞，提示在生理状态下 BBB 内皮细胞可能存在 “捕获和释放” JCPyV 的动态过程。

此外，炎症可能影响 JCPyV 穿越 BBB 的能力。炎症环境会破坏 BBB 的紧密连接，增加其通透性，使病毒更容易通过细胞旁途径进入大脑。JCPyV 感染脉络丛上皮细胞后会分泌促炎趋化因子，可能间接影响神经内皮细胞的屏障功能。

本研究使用的 Mad1/SVE Δ（Turbo）菌株的 JCPyV 不携带削弱病毒与 LSTc 结合的突变。而从 PML 患者大脑和脑脊液中分离的 JCPyV 准种通常存在 VP1 点突变，影响 LSTc 结合。未来研究可进一步探讨 BBB 内皮细胞对这些突变体的转运能力，以及 EVs 在 JCPyV 神经侵袭中的具体作用机制。

材料和方法

1. 细胞和病毒：hCMEC/D3 细胞购自 Creative Biolabs，在完全内皮细胞培养基中培养；SVG-A 神经胶质细胞在最低限度基本培养基（MEM）中培养；iPSC 培养物 IMR90-2 购自 WiCell，在 matrigel 包被的培养板上用 Essential 8（E8）培养基培养。实验中使用的 JCPyV-EV 相关实验均在无 EV 培养基（EVD）中进行。Mad-1/SVEΔ 菌株的 JCPyV（Turbo）通过特定方法制备和纯化，Alexa Fluor 488 标记的 JCPyV 也按既定方法制备。
2. iPS 细胞向内皮样细胞的分化：iPS 细胞按特定步骤分化为内皮样细胞（iPSC-ECs），包括在不同培养基中培养、添加特定生长因子和抑制剂等，分化后的细胞经冻存后在 3 个月内使用。
3. EV 的制备和纯化：SVG-A 细胞感染 JCPyV 后，通过多次离心去除细胞碎片，然后超速离心获得纯化的 EVs，并对其进行粒径、数量和病毒基因组拷贝数的表征。
4. 实验方法：采用流式细胞术检测病毒结合和内化；通过凝集素结合实验标记 α2,6 - 连接的唾液酸；使用 Transwell 培养系统构建 hCMEC/D3 和 iPSC-EC 单层细胞模型，进行通透性测定、P-gp 定向转运检测和跨内皮电阻（TEER）测量；通过 qPCR 定量检测 JCPyV 基因组；用间接免疫荧光法检测病毒感染情况；对 iPSC-ECs 进行免疫荧光染色表征；使用 GraphPad Prism 进行统计分析，以 P < 0.05 为有统计学意义。

致谢

研究团队感谢 Atwood 实验室成员对本文的关键讨论和审阅。该研究得到了 NIH R35 NS5271118、布朗大学 Salomon 和 SEED 奖、Blackman 家族多发性硬化症基金以及布朗大学本科生教学与研究奖的支持。