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这篇研究聚焦于结核病（TB）和非结核分枝杆菌（NTM）感染的诊断难题。通过对比多种检测方法，发现核酸基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）在鉴定分枝杆菌种类和结核分枝杆菌（MTB）耐药性方面优势显著，对指导临床治疗意义重大。
结核病与非结核分枝杆菌感染现状及诊断难题
结核病（TB）严重威胁人类健康，2023 年全球约有 1080 万新发病例，近 125 万人死亡，中国也是 TB 和耐药 TB 高负担国家之一 。非结核分枝杆菌（NTM）感染发病率在全球呈上升趋势，在许多发达国家，NTM 疾病已超过 TB。在中国，NTM 的流行率也逐年增加，NTM 肺病最为常见。由于 NTM 肺病与肺结核在临床、影像学和痰涂片抗酸杆菌染色特征上相似，且多数 NTM 对常用抗结核药物具有固有耐药性或高耐药率，因此准确快速诊断和区分 TB 与 NTM 疾病及其耐药性至关重要。
传统的 TB 诊断方法，如 MTB 培养和药敏试验（DST），虽然被视为金标准，但由于 MTB 生长缓慢，结果通常需要 4 - 8 周，严重延误治疗。传统的 NTM 培养鉴定方法依赖多种复杂检测，存在主观性，影响诊断准确性。基于核酸扩增的检测方法（如 GeneXpert）可快速检测 MTB 和利福平耐药性，但无法全面检测其他抗结核药物的耐药性。基于蛋白质的 MALDI-TOF MS 技术需培养分枝杆菌，限制了其快速诊断能力。因此，基于基因序列多态性的核酸 MALDI-TOF MS 技术应运而生。
研究目的
本研究旨在分析比较核酸 MALDI-TOF MS 与 GeneXpert、实时 PCR、Lowenstein-Jensen（LJ）培养和 DST 在鉴定分枝杆菌种类和检测 MTB 耐药性方面的准确性和可靠性。评估核酸 MALDI-TOF MS 快速鉴定 MTB 和 NTM 的潜力，以及其在检测 MTB 耐药性方面的应用，以提高诊断效率，缩短诊断周转时间，并为个性化治疗提供准确的耐药信息。
材料与方法
- 研究对象和设计：本回顾性研究收集了 2020 年 12 月至 2023 年 4 月解放军总医院第八医学中心结核病老年科 133 例住院患者的完整检测结果。样本包括 66 例支气管肺泡灌洗液（BALF）、33 例痰标本、14 例组织样本、9 例脓液样本、6 例脑脊液、4 例胸腔积液和 1 例尿液样本。研究方案经解放军总医院第八医学中心伦理委员会审查批准。
- 诊断标准：TB 诊断依据中国卫生行业标准《肺结核诊断（WS 288 - 2017）》，满足全身或局部 TB 症状、影像学符合 TB 表现、排除其他疾病且标本无污染，同时符合涂片、培养或核酸检测等阳性条件之一即可确诊。NTM 疾病诊断依据《非结核分枝杆菌病诊断与治疗指南（2020 版）》，满足相应症状、影像学表现、排除其他疾病且标本无污染，同时符合培养、组织病理或核酸检测等阳性条件之一即可确诊。
- 检测方法
- 萋 - 尼抗酸染色（Ziehl–Neelsen acid-fast staining）：按照《肺结核诊断（WS 288 - 2017）》附录 B.2.6.2 进行操作，包括固定、初染、水洗、脱色、复染等步骤，最后镜检并判读结果。
- Lowenstein–Jensen 培养、菌种鉴定和药敏试验：样本预处理后接种到酸改良的 Lowenstein–Jensen（LJ）斜面上，37°C 培养，定期观察。采用 PNB 培养基初步鉴定菌种，对 MTB 新鲜分离株进行药敏试验，检测 10 种药物的耐药性，包括异烟肼（INH）、利福平（RFP）等。
- GeneXpert MTB/RIF：按照试剂盒说明书操作，检测 rpoB 基因及其突变，结果分为 TB 阳性且利福平耐药、TB 阳性且利福平敏感或 TB 未检测到。不同临床标本有不同的处理要求和体积规定。
- 实时 PCR（Real-time PCR）：采用 PCR - 荧光探针法，以 IS6110 为 MTBC 检测靶点，hsp65 基因为分枝杆菌属检测靶点。样本经处理后进行核酸提取、PCR 扩增，根据 Ct 值判断结果。
- 核酸 MALDI-TOF MS：在上海康昕瑞医学检验所采用康昕瑞 TB&DR 检测试剂盒进行检测，可鉴定 MTB 复合群 8 个亚种和 40 种 NTM，检测 16 个耐药基因和 29 个耐药位点对多种抗结核药物的耐药性，主要靶点基因包括 16S rRNA 基因等。
- 统计分析：系统收集临床样本数据，进行数据清洗，去除冗余信息。通过构建混淆矩阵计算灵敏度、特异性、阳性预测值和阴性预测值等性能指标。使用 R 语言的 pROC 包绘制受试者工作特征（ROC）曲线并计算曲线下面积（AUC），使用 irr 包计算 Cohen’s kappa 系数评估检测方法与临床诊断的一致性。同时使用 IBM SPSS Statistics 25 进行描述性统计分析，以 P < 0.05 为差异有统计学意义。
研究结果
- 临床参与者基线特征：研究样本来自解放军总医院第八医学中心结核病老年科患者，包括不同性别和年龄层次，样本类型多样，临床诊断涵盖多种疾病，其中 TB 和 NTM 相关疾病占比较大。
- 萋 - 尼抗酸染色与核酸 MALDI-TOF MS 比较：萋 - 尼抗酸染色阳性检测率为 29.32%（39/133），核酸 MALDI-TOF MS 阳性检测率为 84.96%（113/133）。在不同样本类型中，除脓液、胸腔积液和脑脊液样本外，核酸 MALDI-TOF MS 阳性检测率均显著高于萋 - 尼抗酸染色（P < 0.001）。
- 四种检测方法对 MTB 和 NTM 的诊断性能评估：核酸 MALDI-TOF MS 对 MTB 和 NTM 均具有较高的灵敏度和特异性。对 MTB，灵敏度为 88.07%，特异性为 95.83%；对 NTM，灵敏度为 89.29%，特异性为 97.14%。其总体符合率为 89.47%，Cohen’s kappa 系数为 0.702，优于 LJ 培养、GeneXpert 和实时 PCR。
- 四种检测方法的 ROC 曲线分析：核酸 MALDI-TOF MS 检测 MTB 的 AUC 为 0.920，检测 NTM 的 AUC 为 0.932，均高于 LJ 培养、GeneXpert 和实时 PCR，表明其诊断性能最佳。
- 核酸 MALDI-TOF MS 与其他诊断方法联合检测 MTB 和 NTM 的诊断性能：核酸 MALDI-TOF MS 与 LJ 培养、GeneXpert、实时 PCR 联合检测 MTB 和 NTM 时，AUC 均较高，显示出良好的诊断性能。
- 核酸 MALDI-TOF MS 鉴定分枝杆菌种类及与实时 PCR 和 LJ 培养的比较：核酸 MALDI-TOF MS 检测到 16 例 NTM、85 例 MTB 和 12 例 MTB/NTM 混合感染，阳性检测率为 84.96%；实时 PCR 检测到 12 例 NTM 和 44 例 MTB，阳性检测率为 42.11%；LJ 培养检测到 12 例 NTM 和 42 例 MTB，阳性检测率为 40.6%。核酸 MALDI-TOF MS 与实时 PCR、LJ 培养的阳性检测率差异均有统计学意义（P < 0.01）。
- 核酸 MALDI-TOF MS 与传统 DST 检测 10 种抗结核药物耐药性的比较：核酸 MALDI-TOF MS 与传统药敏试验检测 MTBC 耐药性的一致性较高，INH 为 85%、RFP 为 95%、EMB 为 85% 等。但也存在不一致情况，如核酸 MALDI-TOF MS 可检测到表型敏感菌株中的耐药基因突变，可能与检测异质性耐药有关。
- 核酸 MALDI-TOF MS 与 Xpert MTB/RIF 检测利福平耐药性的比较：在 57 例阳性样本中，核酸 MALDI-TOF MS 与 Xpert MTB/RIF 检测利福平耐药性的一致性率为 94.74%。两者结果存在差异，可能与样本中 MTB 丰度低或已知突变覆盖有限有关。
- 核酸 MALDI-TOF MS、GeneXpert 和传统药敏试验检测利福平耐药性的比较：在 29 例样本中，核酸 MALDI-TOF MS 与传统药敏试验检测利福平耐药性的一致性率为 82.76%，与 GeneXpert 的一致性率为 100%。利福平耐药主要由 rpoB531TCG - TTG 突变引起。
讨论
TB 和 NTM 感染给公共卫生带来严峻挑战，及时准确区分 TB 和 NTM 并评估其耐药性对控制耐药菌株传播、提高治疗效果和降低死亡率至关重要。分子诊断技术虽已取得进展，但仍存在局限性。核酸 MALDI-TOF MS 技术具有快速、准确等优势，可检测多种分枝杆菌种类和耐药基因多态性，能鉴定 8 个 MTB 复合群亚种和 40 种 NTM，检测范围涵盖多种抗结核药物。
本研究中，核酸 MALDI-TOF MS 在检测 MTB 和 NTM 方面表现出色，阳性检测率高，诊断准确性和可靠性强。在分枝杆菌种类鉴定方面，能检测出更多 NTM 种类和混合感染情况。在耐药性检测方面，与传统药敏试验有较高一致性，但也存在不一致情况，可能与检测异质性耐药有关。此外，研究还发现了一些特殊突变，如 rpoB522TCG - TCT 同义突变等，对临床用药有指导意义。
然而，本研究存在一定局限性。作为回顾性研究，无法有效解决结果不一致问题；部分样本未进行所有检测方法，影响全面比较；部分阳性样本未进行耐药检测，NTM 未进行药敏检测，耐药数据不完整；核酸 MALDI-TOF MS 依赖已知耐药基因和突变位点，无法涵盖所有耐药机制。
结论
核酸 MALDI-TOF MS 在快速准确检测分枝杆菌种类和 MTB 耐药性方面优势显著，适用于多种样本类型，可缩短检测时间，有助于 TB 早期诊断和有效治疗。随着对分枝杆菌耐药基因研究的深入，其耐药检测能力将进一步提升。未来研究应扩大样本量、优化实验设计、整合多种检测方法，以提高诊断效能和可靠性，为 TB 防治提供更有力的支持。
