纳米抗体 F-E2：呼吸道合胞病毒（RSV）检测与防控的新希望

这篇研究成功筛选出呼吸道合胞病毒（RSV）检测纳米抗体 F-E2，它能特异性结合 RSV 的 F 蛋白。基于 F-E2 建立的免疫荧光检测方法特异性强、灵敏、经济且快速，在 RSV 防控及相关研究中极具应用潜力。

　　

呼吸道合胞病毒（RSV）感染现状与检测难题

呼吸道合胞病毒（RSV）是全球范围内引发婴幼儿、老年人和免疫缺陷个体下呼吸道疾病的常见病原体。2019 年，全球估计有 3.3 亿例 RSV 相关急性下呼吸道感染，致使 360 万人住院，近 10.14 万 5 岁以下儿童在医院死亡。在婴幼儿中，RSV 是导致呼吸道感染住院的首要原因；在发达国家，它也是 5 岁以下儿童所有住院病因中的首位。此外，体弱老年人的年感染率约为 5% - 10%，其中需住院的重症发生率约 14.5%，病死率达 1.6% ，这给全球公共卫生带来了沉重的医疗成本和防治负担。

目前 RSV 感染的诊断方法多样，如经典的病毒空斑试验、组织培养半数感染剂量（TCID₅₀）、实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）、免疫荧光（IF）试验等。然而，这些方法都存在各自的局限性。空斑试验和 TCID₅₀法耗时久，RSV 需培养约一周，且空斑形成不稳定、边界不清、对细胞和培养基要求严格，实验重复性差。RT-qPCR 虽灵敏度高、特异性强、检测周期短，但提取病毒 RNA 样本操作复杂，易导致 RNA 降解和污染，产生假阳性结果。间接免疫荧光法虽快速、灵敏、特异性好且重复性佳，但样本较多时抗体成本高，需要进一步优化。因此，急需建立一种简单、快速、经济且准确的诊断检测方法。

纳米抗体的优势与研究目标

研究发现，骆驼科动物和鲨鱼等软骨鱼类天然存在重链抗体，其可变重链域之一被鉴定为 VHH，也称为纳米抗体。与传统抗体相比，纳米抗体具有诸多优势。它是最小的天然抗原结合域，分子量约 15kDa，仅为传统抗体的 1/10，能够结合传统抗体难以触及的狭窄表位，具有更好的特异性和亲和力。此外，纳米抗体稳定性好、表达量高、生产成本低且易于工程改造。目前，已有多种纳米抗体及其工程抗体处于临床试验阶段，有望用于肿瘤、自身免疫性疾病和病毒感染等疾病的诊断和治疗。

本研究聚焦于开发新一代 RSV 检测抗体，旨在从基于骆驼抗体重链可变域（VHH）的大型噬菌体展示文库中鉴定出纳米抗体，并期望其能特异性结合 RSV 表面的 F 糖蛋白，用于多种检测实验，进而建立一种高效的检测方法，提升 RSV 的防控水平。

材料与方法

1. 细胞和病毒：选用 Vero 细胞，在 37°C、5% CO₂的环境下，用添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 - 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）进行培养。RSV A2、B 菌株以及临床分离的 HRSV A 菌株（GZ08 - 18，GenBank 登录号 KP119747）分别由相关研究人员提供。感染 RSV A2 的 Vero 细胞在感染后 5 - 7 天收获，经反复冻融三次裂解细胞，离心去除细胞碎片，通过间接免疫荧光试验定量病毒滴度，病毒储存于 - 80°C 备用。
2. RSV（A2 株）F 蛋白的构建、表达和纯化：获取 RSV（A2 株）F 蛋白（post F）基因序列后，将其编码序列克隆到哺乳动物表达载体 PTT5 中，得到 PTT5 - post F 重组质粒。利用聚乙烯亚胺将目标质粒转染到 HEK 293F 细胞中，在特定条件下培养 4 天。收集细胞培养上清液，先后通过 0.22μm 无菌注射器过滤器过滤，再用 5mL NI - NTA 亲和柱和 HiTrap Protein A 柱进行纯化。收集洗脱峰对应的洗脱液，用 2×SDS 上样缓冲液稀释并变性，通过 SDS - PAGE 鉴定目标蛋白条带及纯度，最后浓缩、定量、分装并储存于 - 80°C。
3. 针对 post F 的纳米抗体淘选和鉴定：按照先前描述构建大型单峰骆驼 VHH 噬菌体文库。将 0.1mg/mL 的 post F 抗原包被在微孔板上，经洗涤、封闭后，加入噬菌体文库进行第一轮淘选。孵育、洗涤后，用胰蛋白酶消化收集结合的噬菌体，感染大肠杆菌 TG1 细胞进行扩增。第二轮淘选时降低抗原浓度并减少输入噬菌体数量，最后通过单克隆噬菌体 ELISA 从两轮淘选的结果中鉴定出 96 个个体，对候选阳性克隆进行测序分析。
4. 蛋白质免疫印迹（Western blot）：收集感染的 Vero 细胞，经反复冻融处理后固定、重悬，用含新鲜 10%β - 巯基乙醇的 2×SDS 上样缓冲液稀释并变性。蛋白质样品经 10% SDS - PAGE 分离后转移到 PVDF 膜上，用 5% 脱脂牛奶在 PBST 中封闭 1 小时，分别与一抗 F - E2 或二抗（HRP 标记的羊抗人 IgG（H + L））在室温下温和振荡孵育 1 小时，通过超灵敏 ECL 化学发光溶液检测蛋白条带。
5. 酶联免疫吸附试验（ELISA）：将 1μg/mL 的 RSV 特异性抗原 RSV A2 F（post F）包被在 96 孔板上过夜，洗涤、封闭后，加入起始浓度为 30nM 的 F - E2 进行系列三倍梯度稀释并孵育。再次洗涤后，与二抗（兔抗人 IgG - Fc HRP）孵育，加入 TMB 底物溶液显色，用硫酸终止反应，在 450nm 波长下检测吸光度值。
6. 流式细胞术分析：将 Vero 细胞接种在 12 孔板中，感染 RSV 后在特定条件下培养。收获感染 60 小时后的细胞，用 4% 多聚甲醛固定，离心洗涤后用 5% 脱脂牛奶和通透缓冲液封闭、通透。细胞沉淀重悬于含 F - E2 抗体的 1×PBS 中孵育，再加入异硫氰酸荧光素（FITC）标记的羊抗人 IgG 孵育，最后用流式细胞仪检测，并用 FlowJo_V10_CL 软件分析原始数据，至少进行三次独立实验。
7. 免疫组织化学分析（IHC）：用异氟烷轻度麻醉 BALB/c 小鼠，经鼻感染 1×10⁶ 噬斑形成单位的 RSV A2。4 天后处死小鼠，收集整个肺组织固定在 4% 多聚甲醛中，脱水、石蜡包埋后制成 4μm 厚的石蜡切片。切片经脱石蜡、水化、抗原修复、封闭后，加入一抗 F - E2 孵育，洗涤后与二抗孵育，最后用 3,3 - 二氨基联苯胺溶液显色，在显微镜下观察。
8. 间接免疫荧光试验：将 Vero 细胞接种在 96 孔培养板中，细胞密度达到 70% - 80% 时感染病毒，覆盖含 2% FBS 的 DMEM 继续培养 48 小时。固定细胞后洗涤，用纳米抗体 F - E2（10ng/mL）染色，洗涤后与二抗（FITC - 羊抗人 IgG）在黑暗中孵育，用 DAPI 标记细胞核，用 ImageXpress MicroConfocal 显微镜成像。
9. 统计分析：使用 GraphPad 软件进行统计分析，采用未配对、双尾 Student's t 检验评估两种处理之间差异的统计学意义，以P < 0.05、P < 0.01 和P < 0.001 表示统计学显著性，数据以平均值 ± 标准误表示。

研究结果

1. 抗原制备、骆驼免疫和文库构建：将标记有 His 标签的 F 蛋白 DNA 序列克隆到哺乳动物表达载体 PTT5 中，在 HEK 293F 细胞中表达。通过 Ni NTA 柱收集抗原蛋白，SDS - PAGE 结果显示目标条带单一无杂质。用高纯度的 RSV F 蛋白以 0.5mg / 次的剂量免疫单峰骆驼 4 次，ELISA 检测血清抗体滴度，当 OD₄₅₀为 0.1 且相应血清稀释比超过 10000 时免疫效果良好。收集血液，分离外周血单个核细胞（PBMCs），提取总 RNA 并逆转录为 cDNA，通过 PCR 扩增得到约 400bp 的 VHH 编码区域，即纳米抗体的基因序列。将 VHH 片段克隆到噬菌粒载体 PR2 中，电转化到大肠杆菌 TG1 中，构建出含有纳米抗体片段的噬菌体文库。
2. 纳米抗体的筛选、表达和纯化：经过两轮淘选，获得了 3.32×10⁵个克隆的文库。通过单克隆噬菌体 ELISA 进一步筛选出 95 个阳性抗体，测序得到 86 个序列完全不同的个体，最终根据序列和亲和力差异确定了 7 个候选纳米抗体。将候选纳米抗体构建成 IgG 样分子，通过 Protein A 柱从细胞上清液中收集 homo - bivalent Nb - TEV - Fc 融合蛋白，SDS - PAGE 结果显示候选抗体条带单一无杂质。
3. 候选纳米抗体与 RSV F 的高亲和力结合：构建候选纳米抗体的 IgG 样分子（F - E2 - Fc），以 RSV F（post F）为抗原进行 ELISA，发现大多数纳米抗体的 EC₅₀值在 4 - 11ng/mL 之间，其亲和力超过常用的 MPE8 和帕利珠单抗。免疫荧光试验表明 F - E2 的荧光信号清晰，能特异性识别天然 F 蛋白。通过竞争 ELISA，以 6 种已知抗原结合区域的 RSV F 抗体为竞争抗体，发现 F - E2 与 101F（IV）存在明显竞争关系，推测 F - E2 可能结合 RSV F 的位点 IV。
4. 间接免疫荧光法检测 RSV 滴度的建立与优化：研究不同标签对 F - E2 结合能力的影响，将 F - E2 分别融合到 IgG1 Fc 片段和标记 6×His 标签进行纯化。免疫荧光试验显示，F - E2 - Fc 和 F - E2 - His 均能特异性结合不同 RSV 实验室菌株 A2、B 和临床分离株（GZ08 - 18）的天然 F 蛋白。梯度稀释 F - E2 进行免疫荧光实验，发现其在 10ng/mL 的工作溶液浓度下仍有明显荧光信号，而传统检测抗体帕利珠单抗需在微克水平使用，表明 F - E2 成本效益高且高效。对 RSV A2 进行 10 倍梯度稀释后检测，当病毒浓度稀释到 10⁸时仍能检测到特征性绿色荧光，验证了 F - E2 的高灵敏度。用 F - E2 检测感染不同呼吸道相关病毒的细胞，结果显示感染 OC43、229E 和 NL63 病毒的细胞无阳性信号，而感染 RSV 的细胞有明显特异性荧光信号，证明基于 F - E2 的 RSV 免疫荧光检测方法特异性良好。
5. 基于 F - E2 建立 RSV 中和抗体效价检测方法：选择帕利珠单抗和尼塞维单抗两种市售 RSV 预防抗体作为阳性对照，建立 8 个梯度、起始浓度为 1μg/mL 的抗体系列四倍梯度稀释，与病毒孵育后加入培养细胞，通过免疫荧光试验评估 RSV 滴度。结果显示，帕利珠单抗和尼塞维单抗对 RSV A 亚型均有中和作用，IC₅₀值分别为 240.2ng/mL 和 13.48ng/mL。为验证该方法的通用性，选择扶正解毒方进行实验。将扶正解毒方梯度稀释后与 RSV 孵育，再加入 Vero 细胞，结果表明随着扶正解毒方浓度增加，平均病毒载量降低，其对 RSV 复制有显著抑制作用，IC₅₀值为 0.4073mg/mL，进一步证实了 F - E2 在 RSV 中和试验中的适用性。
6. 纳米抗体 F-E2 的多功能应用：在细胞流式分选实验中，用 F-E2 标记感染 RSV A2 和 B 菌株的细胞，并设置帕利珠单抗和尼塞维单抗作为阳性对照，发现 F-E2 标记的阳性细胞数量更多，表明其结合活性更好。在 Western blot 实验中，F-E2 能特异性结合 RSV F 蛋白的线性表位。在小鼠组织的 IHC 实验中，F-E2 比帕利珠单抗特异性更好，背景信号更低。这一系列实验证明 F-E2 可用于多种 RSV 检测方法，且特异性和通用性更强。

研究讨论

本研究成功通过构建骆驼免疫文库和噬菌体展示技术筛选出 RSV 检测纳米抗体 F-E2，它能特异性结合 RSV F 并识别抗原表位 IV。以 F-E2 作为免疫荧光一抗建立的简单、快速且经济的 RSV 滴度检测方法，有助于早期识别 RSV 感染，对减少 RSV 传播具有重要意义。该方法还可用于测定候选抗体的中和效价，为筛选 RSV 中和抗体和治疗药物提供科学依据。

目前测量 RSV 滴度的方法各有优劣，空斑试验中 RSV 空斑形成不明显且计数困难，影响滴定准确性；RT-qPCR 虽灵敏度和特异性高，但成本高、结果不直观且易出现假阳性。间接免疫荧光试验则具有特异性好、稳定性高、准确直观等特点，应用广泛。

与常用的单克隆抗体 MPE8 相比，F-E2 作为荧光检测纳米抗体具有荧光强度强、背景低、表达水平高的特点，荧光信号更清晰，用量更少，经济有效。F-E2 融合 IgG1 Fc 片段后，虽分子量有所增加，但仍远小于传统抗体。这种 homo-bivalent 纳米抗体 - TEV-Fc 融合蛋白具有诸多优势，如结合亲和力显著提高、实验成本低、应用范围广，且 IgG1 Fc 的添加可延长抗体半衰期，便于后续活体动物实验标记。

综上所述，F-E2 在 RSV 感染检测试剂开发、靶向药物递送和中和抗体治疗等方面具有广阔的应用前景，具有重要的经济和社会意义。不过，F-E2 与 RSV F 高亲和力结合的具体分子机制还需通过蛋白质结构分析进一步探究。