新型工具助力脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）研究：突破遗传局限与培养基优化

为解决脆弱拟杆菌遗传工具受限阻碍其机制研究的问题，研究人员开展了关于该菌基因编辑和培养的研究。他们构建了新型载体和半合成培养基，这为深入探究脆弱拟杆菌的生物学特性提供了有力工具。

　　脆弱拟杆菌是一种机会性厌氧菌，在健康人体肠道微生物群中占 1% - 5%。由于遗传工具相对有限，其机制研究受到阻碍。本文描述了用于脆弱拟杆菌基因敲除和表达的新型载体，以及用于培养脆弱拟杆菌菌株 P207 的半合成培养基。新分离细菌的遗传可操作性有限，阻碍了对它们的研究。这里介绍了用于肠道微生物脆弱拟杆菌（特别是从发炎的回肠袋中分离出的菌株 P207）遗传操作的更多工具。研究构建了一种半合成生长培养基和新型质粒，用于脆弱拟杆菌的机制研究。这些质粒包括组成型和诱导型表达载体，具有通用的多克隆位点，还可选择进行 C 端 3xFLAG 标记和 / 或 N 端、C 端荧光蛋白融合。通过改造 pCOLADuet1 载体的多克隆位点区域，增强了等位基因交换载体的多克隆盒。还生成了一系列复制型（RepA）和整合型载体（IntN1）。每个载体系列都可选择 C 端 3xFLAG 标签融合，以及与荧光蛋白 mScarlet - I、mNeonGreen 和 iLOV 进行 N 端和 C 端融合。由于脆弱拟杆菌是厌氧生物，像 mNeonGreen 和 mScarlet - I 等荧光团需要有氧恢复来促进成熟。虽然有氧恢复 1 小时后能检测到 mNeonGreen 的荧光，但 mScarlet - I 成熟时间较长，还需进一步优化，厌氧荧光蛋白 iLOV 也因荧光信号弱有待优化。由于脆弱拟杆菌菌株 P207 在已有的确定培养基（如 M9S）中生长不良，研究人员通过 KBase 中的 fba_tools 应用预测营养缺陷型，对生长培养基成分进行优化，确定了对西罗血红素、L - 缬氨酸和腐胺的潜在营养缺陷。还发现脆弱拟杆菌菌株 NCTC9343 和 638R 对 L - 缬氨酸及其他氨基酸存在营养缺陷。由于补充单一支链氨基酸会抑制生长，所以在 M9S 中添加 1% 酪蛋白氨基酸，显著提高了所有菌株的培养密度。研究人员还提供了用于替换抗生素抗性基因和表达启动子的引物序列，荧光蛋白也可通过预设引物转移到其他启动子载体中。希望这些载体能促进厌氧生物中荧光蛋白应用的进一步优化。研究感谢密歇根州立大学基因组学核心在桑格测序方面的帮助，以及 Maeve McLaughlin 赠送的带有 3xFLAG 标签的质粒和荧光蛋白，pGEX iLOV 由 John Christie 赠送（Addgene 质粒编号 26587）。该研究得到了 NIDDK（RC2DK122394）和 NIGMS（R35GM131762）的资助，也是 BER 基因组科学计划的一部分。美国能源部系统生物学知识库（KBase）由美国能源部科学办公室生物与环境研究办公室资助。