拉帕替尼逆转人 MRP4 介导的多药耐药的结构基础：解锁癌症治疗新希望

这篇研究聚焦于多药耐药蛋白（MRPs）在癌症耐药中的关键作用，尤其是人 MRP4（hMRP4）。通过实验揭示了拉帕替尼（LAP）能逆转 hMRP4 介导的长春新碱（VCR）和 5 - 氟尿嘧啶（5-FU）耐药，并解析了相关的冷冻电镜结构，为癌症治疗提供了重要依据。

　　

研究背景

癌症严重威胁全球健康，癌细胞的多药耐药（MDR）是化疗面临的重大挑战。ATP 结合盒（ABC）转运体是导致 MDR 的主要因素之一，其中多药耐药蛋白（MRPs）属于 ABCC 超家族，在多种疾病及癌细胞耐药中发挥重要作用。

人 MRP4（hMRP4）由 ABCC4 基因编码，能转运多种物质，包括抗病毒药、抗生素、心血管药和抗肿瘤药等。其在多种癌症中高表达，与肿瘤细胞增殖和化疗耐药密切相关，是潜在的治疗靶点。然而，此前对 MRP4 抑制剂及其抑制肿瘤药物转运的分子机制了解较少。

研究方法

1. 药物敏感性测定：用携带 hMRP4 过表达质粒或空载体的细胞，通过 CCK-8 法测定多种临床药物的半最大抑制浓度（IC₅₀），评估细胞对药物的耐药性，筛选 hMRP4 的潜在抑制剂。
2. ATP 酶活性测定：在昆虫细胞中表达并纯化 hMRP4_WT及突变体，用 ATP 酶活性测定试剂盒检测其 ATP 酶活性，研究不同底物和抑制剂对其活性的影响，并进行酶动力学分析。
3. 冷冻电镜（cryo-EM）结构测定：将纯化的 hMRP4 组装到大豆极性脂质纳米盘，与底物（VCR、5-FU）或抑制剂（LAP）及核苷酸孵育后制备样品，通过 cryo-EM 技术解析其结构。
4. 突变体构建与功能验证：构建 hMRP4 的多个突变体，通过免疫印迹检测蛋白表达，用 ATP 酶活性测定和微尺度热泳（MST）分析等方法验证突变体对底物或抑制剂结合及 ATP 酶活性的影响。

研究结果

1. LAP 逆转 hMRP4 介导的 VCR 和 5-FU 耐药：分析肿瘤和正常组织样本中 hMRP4 的表达，发现其在多种肿瘤中高表达。药物敏感性实验表明，hMRP4 与多种药物耐药相关，如 VCR 和 5-FU。LAP 可恢复 hMRP4 转染细胞对 VCR 和 5-FU 的敏感性，且其逆转耐药效果强于已报道的 ceefourin-1。此外，PRO 和 INDO 也可能是 hMRP4 的抑制剂。
2. hMRP4 的 ATP 酶活性特征：纯化的 hMRP4_WT在洗涤剂溶液和脂质组装的纳米盘中均有 ATP 酶活性，其中在大豆极性脂质提取物（SOY）重构的纳米盘中活性最高。不同底物和抑制剂对 hMRP4_WT的 ATP 酶活性有不同影响，VCR、5-FU 等刺激其活性，LAP 等抑制其活性。酶动力学分析显示，VCR、5-FU 和 LAP 与 hMRP4_WT有不同程度的相互作用。
3. hMRP4 复合物的结构概述：获得了 hMRP4 与底物或抑制剂结合的三种 cryo-EM 重构结构，均为内向开放（IF）构象，具有典型的 IV 型 ABC 转运体结构。NBDs 在 ABC 转运体中高度保守，结合腺嘌呤核苷酸及其类似物的关键残基对 hMRP4 的 ATP 酶活性很重要。配体结合后，NBDs 发生微妙扭转，NBS I 内部距离略有缩小。
4. hMRP4 对底物 VCR 和 5-FU 的识别：VCR 和 5-FU 结合在 hMRP4 两个交换的跨膜结构域（TMDs）界面的跨膜腔（TM cavity）内。VCR 结合在由多个残基形成的疏水口袋（H-pocket）和带正电的亲水口袋（P-pocket）中，5-FU 主要容纳在 H-pocket 中。底物结合诱导结合腔内一些残基的侧链发生局部调整，突变这些关键残基会降低底物刺激的 ATP 酶活性和结合亲和力。
5. LAP 逆转 hMRP4 介导的耐药机制：LAP 的结合位点与 VCR 和 5-FU 部分重叠，其中心喹唑啉部分锚定在 H-pocket，L 形 3 - 氟苯基部分钩入 P-pocket，独特的 2 - 甲基磺酰基乙氨基甲基呋喃基团延伸至通道隧道出口。LAP 与 hMRP4 的结合亲和力高于 VCR 和 5-FU，可能通过限制 TMDs 的运动，尤其是 TM2 和 TM12，将 hMRP4 困在 IF 构象，从而阻断底物转运。

研究讨论

本研究表明 hMRP4 介导细胞对 VCR 和 5-FU 的耐药，LAP 可有效逆转这种耐药，为癌症联合治疗提供了思路。通过解析 hMRP4 与底物或抑制剂结合的结构，揭示了其底物识别、转运及 LAP 抑制的机制。

与其他多药转运体相比，hMRP4 有不同的底物偏好和抑制剂结合模式。其底物 / 抑制剂结合口袋主要由 TM5、TM6 和 TM12 形成，部分关键残基在 hMRP4 同源物中保守，在其他 MRPs 中不保守，提示不同 MRP 家族可能介导对不同底物的耐药。

hMRP4 通过构象转变循环以交替 access 模式转运底物，LAP 因高亲和力优先结合，限制 TMDs 运动，阻断底物转运。但 LAP 是否为低效转运的闲置底物仍需进一步研究。

研究局限

本研究虽揭示了 LAP 对 hMRP4 的抑制机制，但需在动物模型中进一步验证 LAP 在体内逆转 hMRP4 介导的耐药作用，这对抑制剂的未来开发至关重要。

研究意义

本研究丰富了对 hMRP4 配体识别和转运机制的认识，揭示了 LAP 作为 hMRP4 强效抑制剂逆转耐药的结构基础，为 hMRP4 抑制剂在对抗 MDR 癌症中的应用提供了理论依据，为基于结构的药物设计和优化提供了指导。