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球孢子菌病（coccidioidomycosis）治疗手段有限，现有抗真菌药物存在诸多问题。本文通过优化代谢检测法筛选药物库，发现 30 种有潜力的抗球孢子菌化合物，其中 5 种与两性霉素 B（AmB）有协同作用。还证实减毒株可用于药物筛选，为治疗该疾病提供新思路。
球孢子菌病现状与治疗困境
球孢子菌病，又称谷热，是由球孢子菌（Coccidioides immitis和Coccidioides posadasii）引起的真菌性感染疾病，在南北美洲碱性沙漠地区流行。气候变化导致沙漠化，使病原体传播范围扩大。
人们接触被污染土壤中的关节孢子（arthroconidia）后，吸入的关节孢子在体内转化为球孢子（spherule），球孢子成熟后释放内生孢子（endospore），引发感染循环。多数感染者无症状，但部分会出现类似流感症状，常被误诊为社区获得性肺炎，延误治疗。约 5 - 10% 的患者会出现肺部后遗症，1 - 7% 的患者会发生播散性感染，累及骨髓、关节、皮肤和大脑等，治疗困难，死亡率高。
目前，系统性真菌感染的治疗药物有限，仅 11 种分属 4 类。治疗球孢子菌病主要依靠三唑类和两性霉素 B（AmB）。然而，三唑类药物如氟康唑（FLU）耐药性逐渐增加，AmB 因肾毒性仅用于严重播散性感染。棘白菌素类和氟胞嘧啶治疗效果不佳，因此急需开发新型抗球孢子菌药物。
筛选平台的开发与优化
球孢子菌具有独特的球孢子形态。研究人员比较了关节孢子、球孢子初始体（spherule initials）和分段球孢子对 AmB 的药敏性，发现球孢子初始体对 AmB 的敏感性与其他两种形态不同，其 50% 抑制浓度（IC50）为 0.12μM。考虑到球孢子初始体的临床相关性和生长周期特点，选择其作为筛选的理想形态。
基于代谢抑制原理，研究人员开发了抗球孢子菌药物筛选平台。将球孢子初始体接种到 96 孔板中，加入 10μM 筛选化合物、二甲基亚砜（DMSO）阴性对照、AmB 阳性对照或培养基，培养 24 小时后，去除药物上清液，加入 XTT（2,3 - 双 (2 - 甲氧基 - 4 - 硝基 - 5 - 磺基苯基)-2H - 四唑 - 5 - 甲酰胺），孵育 4 小时后读取 490nm 处的吸光度（OD490），以此评估细胞活力。
新型抗球孢子菌药物的筛选与鉴定
研究人员使用上述 XTT 检测法，对来自四个药物库的 7722 种化合物进行测试。通过将各孔比色读数标准化至平均 DMSO 对照计算抑制百分比，将抑制率≥70% 的化合物定义为潜在有效化合物。同时，使用 B 分数（B - scores）进行数据分析，B 分数是一种考虑药物筛选中每日和位置变异性的统计分析方法。综合抑制百分比和 B 分数（B 分数≤ - 3），最终确定了 42 种符合标准的化合物。去除毒素、临床批准的抗真菌药物和 FDA 撤回的化合物后，得到 27 种不同类别的潜在抗球孢子菌药物。
此外，研究人员还评估了之前在针对白色念珠菌（Candida albicans）和新型隐球菌（Cryptococcus neoformans）的筛选中发现的 3 种药物，共 30 种化合物进入后续研究。
命中化合物的浓度依赖性测定与活性评估
为确定 30 种筛选出化合物的效力，研究人员进行浓度依赖性测定。将球孢子初始体与 40 - 0.04μM 的化合物进行 2 倍系列稀释测试，使用 GraphPad Prism v10.1.0 软件中的可变斜率四参数非线性回归模型计算 IC50值。结果显示，27 种药物的 IC50值在 0.55 - 17.94μM 之间，根据 PubChem 数据库将这些化合物分为 6 类。最终筛选出 12 种 IC50值低于 6μM 的化合物进行进一步研究。
化合物与现有抗真菌药物的协同作用研究
研究人员通过棋盘协同试验，探究 12 种筛选出的化合物与 AmB、FLU 和卡泊芬净（CAS）联合使用时的协同效应。使用 Synergy Finder 3.0 软件计算 Bliss 协同分数，定义 Bliss 最协同区域（MSA）分数≥10 为协同作用， - 10 到 10 为相加或无作用，≤ - 10 为拮抗作用。
结果发现，5 种化合物（奥昔卡因（OXE）、氯硝柳胺乙醇胺（NEN）、10058 - F4、氯硝柳胺（NIC）和戊烷脒依西酸盐（PENT - I））与 AmB 联合使用时表现出协同作用，MSA 分数在 10.98 - 29.32 之间，但这些化合物与 FLU 或 CAS 均未表现出协同作用。同时，还观察到一些拮抗作用，如 SKF 与 AmB、TYR9 与 FLU、NIC 与 CAS 之间。
化合物对球孢子菌细胞形态的影响
利用图像流式细胞术研究 5 种与 AmB 协同作用化合物对球孢子菌细胞形态的影响。将球孢子初始体与 20μM 的药物、AmB、FLU 或 CAS 孵育 24 小时，用钙荧光白（CFW）、Syto9 和 MitoTracker Red CMXRos（MitoRed）染色后进行分析。
结果显示，NEN 和 NIC 处理的样本中，大球孢子的百分比显著降低；NIC 处理的细胞 CFW 和 MitoRed 的平均荧光强度（MFI）显著降低，与 CAS 处理的细胞相似，但对 Syto9 的 MFI 值无影响；NEN 和 10058 - F4 处理的细胞 CFW 的 MFI 降低；OXE 和 PENT - I 处理的细胞 Syto9 的 MFI 显著升高。这些结果表明，5 种化合物对球孢子菌的影响具有独特模式，与传统抗真菌药物不同。
减毒株在药物筛选中的应用评估
研究人员评估了减毒株C. posadasii ?cts2/ard1/cts3（?T）作为药物筛选替代菌株的可行性。?T 突变体通过删除两个几丁质酶基因（cts2、cts3）和截断阿拉伯醇 - 2 - 脱氢酶 1（ard1）表达构建而成，其在 BSL - 2 实验室即可操作。
使用 Selleck L8200 文库对?T 突变体和野生型C. posadasii C735 进行筛选，发现 8 种化合物对两者均有抑制作用。两者生长抑制活性的皮尔逊相关系数（r）为 0.62（P < 0.0001），表明?T 减毒株可作为在 BSL - 2 实验室筛选抗球孢子菌药物的替代菌株，后续再用野生型菌株进行验证。
研究讨论
本研究的 XTT 比色检测法优化了现有的抗真菌药物筛选框架，以球孢子初始体为靶点，筛选速度更快。研究确定了多种具有抗球孢子菌活性的化合物，其中 12 种 IC50值低于 6μM，5 种与 AmB 有协同作用，这为联合治疗提供了新选择。
通过图像流式细胞术分析发现，5 种协同化合物对球孢子菌细胞形态的影响与传统抗真菌药物不同，可能具有独特的作用机制，但具体机制需进一步研究。此外，研究还发现卤化水杨酰苯胺类化合物具有抗球孢子菌潜力，值得深入研究。
研究证实了?T 减毒株可作为药物筛选的替代菌株，提高了抗球孢子菌药物筛选的可及性。不过，C. posadasii和C. immitis在生长、遗传和蛋白质方面存在差异，可能影响药物疗效，这方面仍有待探索。
总之，本研究开发并优化了在 BSL - 3 条件下筛选抗球孢子菌化合物的方法，评估了化合物的体外效力、协同活性和对球孢子菌表型的影响，为抗球孢子菌治疗药物的开发提供了重要基础，有望推动谷热治疗领域的发展。
