鼠疫耶尔森菌 F1 荚膜增强小鼠模型中从哺乳动物到跳蚤传播的关键作用探秘

本文研究鼠疫耶尔森菌（Yersinia pestis）F1 荚膜作用。F1 荚膜由caf操纵子编码，虽对部分哺乳动物非必需，但自然界中 F1 阴性菌株罕见。研究发现，F1 阴性 Δcaf突变株毒力减弱，菌血症水平低，影响向跳蚤传播，F1 荚膜或增强传播循环。

　　

引言

鼠疫耶尔森菌在哺乳动物宿主体内有一个显著特征，即被类似荚膜的结构包裹。这个荚膜物质最初被分离为一种水溶性蛋白质组分（Fraction I 或 F1），它由单一蛋白质 Caf1 的非共价连接线性聚合物组成的蛋白质原纤维聚集体构成，由位于约 100kb 的鼠疫耶尔森菌质粒 pFra 上的caf操纵子编码 ，该操纵子包含caf1结构基因、caf1M周质伴侣基因、caf1A外膜 usher 基因以及相邻的caf1R转录调节基因。F1 荚膜在 37°C 时大量产生，26°C 或更低温度时则不产生，且在感染过程中会大量释放到周围介质、宿主血液和其他组织中。

F1 蛋白荚膜被认为是一种毒力因子，它能抑制巨噬细胞和上皮细胞的内化作用，可能是通过掩盖或干扰粘附素 - 受体相互作用实现的。此外，短的未聚集 F1 单位可结合人 IL - 1B，在感染后期诱导非保护性的促炎反应，导致败血症休克和死亡。然而，多年来的多项研究表明，在实验室小鼠、豚鼠和非人灵长类动物中，F1 荚膜并非必需的毒力决定因素 ，不同 F1 阴性菌株的半数致死量（LD₅₀）与野生型鼠疫耶尔森菌相比无显著差异，尽管感染后死亡时间往往会延长。但也有研究发现，在某些动物模型中 F1 对完全毒力是必需的。而且，F1 荚膜在跳蚤载体中不产生，但感染野生型鼠疫耶尔森菌的跳蚤叮咬瑞士韦伯斯特小鼠后，鼠疫发病率比感染 F1 阴性突变株的跳蚤叮咬的小鼠要高一些。

虽然 F1 荚膜可能不是必需的毒力因子，但 F1 阴性自然分离株的罕见性以及感染期间产生的大量荚膜（即使它会诱导保护性免疫反应）表明，其具有重要的生物学功能，受到正选择压力的维持。此前有研究探讨了 F1 荚膜对从跳蚤到哺乳动物宿主传播后疾病进展的影响，而本研究则评估了 F1 荚膜对从哺乳动物到跳蚤这一传播方向的影响，发现 F1 荚膜是产生典型终末期鼠疫高菌血症水平的重要因素，对成功感染吸血跳蚤至关重要，可能在维持自然界中稳定的鼠疫传播循环中发挥重要作用。

材料和方法

1. 细菌菌株：使用了毒力野生型（WT）鼠疫耶尔森菌 195/P 菌株及其一种 Δcaf衍生菌株，该衍生菌株大部分caf1M1A1操纵子被删除并替换为卡那霉素抗性基因。此外，本研究还构建了一种独立衍生的 195/P 的 F1 阴性突变株 Δcaf1，通过 PCR 引物从 pUC4K 扩增卡那霉素抗性基因（aph1），并将其电穿孔导入含有 pJS06 质粒（编码 λ 红色重组酶蛋白和用于反向选择的sacB基因）的 WT 鼠疫耶尔森菌 195/P 中，筛选出双交换将caf1基因替换为aph1的卡那霉素抗性细菌，再在含 7% 蔗糖的刚果红琼脂上筛选去除 pJS06 质粒的突变克隆。通过 PCR、F1 ELISA 和体外沉降试验验证 Δcaf1突变株中aph1的插入和caf1的缺失。利用自杀载体 pCVD442 和等位基因交换对 Δcaf1突变株进行互补，将原始的天然caf1基因替换aph1基因，经 PCR 验证恢复的克隆含有全长caf1且不含aph1，并通过 ELISA 和体外沉降试验确认该互补菌株（Δcaf1-comp）能正常产生 F1。
2. F1 表达检测：采用 ELISA 法在 37°C 下确认鼠疫耶尔森菌菌株 F1 的表达（或缺失）情况。将从冷冻甘油储备液中培养 24h 的细菌离心，重悬于无菌蒸馏水中，制备热杀死裂解物，测量裂解物总蛋白含量，稀释后加入 96 孔 ELISA 板孔中，以包被缓冲液作为阴性对照，经过过夜包被、封闭、添加小鼠抗鼠疫耶尔森菌 F1 单克隆抗体、洗涤、标记山羊抗小鼠 IgG 抗体辣根过氧化物酶结合物等步骤，最后使用 Ultra TMB - ELISA 底物显色，在 Synergy Mx 微孔板读数仪上读取 450nm 处的吸光度。
3. 沉降试验：该试验用于衡量细菌聚集情况。将菌株从冷冻储备液接种到补充有 10μg/mL 氯化血红素、4mM CaCl₂和 4mM MgCl₂的 LB 培养基中，在 28°C 振荡培养 24h，再接种到相同培养基中，分别在 20°C 和 37°C 振荡培养至稳定期。振荡均匀后测量 600nm 处的吸光度（A₆₀₀，t₀），然后在室温下静置 4h，从管顶部吸取 1mL 等分试样，再次测量A₆₀₀（t₄），按公式 1 - （t₄/ t₀）计算沉降百分比。
4. 小鼠感染实验：选用 8 - 12 周龄的无特定病原体雌性落基山实验室瑞士韦伯斯特（RML）小鼠。将细菌从冷冻甘油储备液在补充有 10μg/mL 氯化血红素的 LB 培养基中培养，经过传代、稀释、计数后，用 27G 针头和注射器在小鼠右胁部皮内注射 10μL 菌液，确定实际接种剂量。当小鼠出现濒死症状（嗜睡、弓背、毛发粗糙、对刺激无反应）时，对其实施安乐死并记录感染后时间。部分小鼠在安乐死前皮下注射氯胺酮 / 甲苯噻嗪麻醉，让未感染的雌性印鼠客蚤（Xenopsylla cheopis）在麻醉小鼠右胁部吸血 30min，检查跳蚤吸血情况后将其冷冻。采集安乐死小鼠的心脏血液样本和脾脏，测定血液样本和脾脏匀浆中的细菌载量。
5. 吸血跳蚤细菌载量测定：将冷冻的跳蚤解冻、表面消毒，在含 1mL PBS 的珠子管中用 FastPrep - 24 匀浆器研磨，稀释后在血琼脂（BA）上平板培养，测量细菌载量，计算每只跳蚤观察到的与预期细菌载量的比值，预期值根据跳蚤吸食的小鼠菌血症水平和雌性印鼠客蚤平均吸血量（0.43μL）计算。
6. 统计分析：采用 Kruskal - Wallis ANOVA 检验，随后进行 Dunn 多重比较检验，比较沉降率、中位死亡时间、脾脏和血液滴度以及个体小鼠脾脏和血液滴度的差异。通过t检验比较感染 F1 阳性菌株（WT、Δcaf1-comp）和 F1 阴性菌株（Δcaf、Δcaf1）的小鼠吸血跳蚤中观察到的与预期细菌载量的比值。

结果

1. F1 阳性和 Δcaf F1 阴性鼠疫耶尔森菌 195/P 菌株的表型比较：F1 荚膜在 37°C 时大量产生，在 26°C 以下不产生。通过体外 F1 ELISA 和沉降试验验证了两个caf突变株不产生 F1，而 Δcaf1-comp 菌株恢复 F1 产生。沉降试验中，F1 阳性的 WT 和 Δcaf1-comp 菌株在 37°C 时 F1 表达抑制了细菌自聚集，沉降率低；而 F1 阴性的 Δcaf和 Δcaf1菌株在 20°C 和 37°C 都表现出较高的自聚集，沉降率高。
2. F1 阴性鼠疫耶尔森菌突变株对 RML 小鼠有毒力，但终末期疾病的中位时间增加：感染不同菌株的小鼠实验结果显示，F1 阴性的 Δcaf菌株仍有毒力，但死亡率（50% - 89%）略低于 F1 阳性菌株（88% - 100%）。感染 Δcaf菌株的小鼠终末期疾病的中位时间显著长于感染 WT 195/P 或 Δcaf1-comp 菌株的小鼠，感染 Δcaf1菌株的小鼠终末期疾病的中位时间也长于感染 F1 阳性菌株的小鼠，但由于样本量较小，差异未达到统计学意义。
3. F1 阴性鼠疫耶尔森菌突变株在小鼠中产生高菌血症的能力受损：在疾病终末期，各菌株在小鼠脾脏细菌载量上无显著差异。然而，感染两个caf突变株的小鼠终末期菌血症水平显著低于 F1 阳性的 WT 和 Δcaf1-comp 菌株，且大多低于向吸血印鼠客蚤输送 1 个半数感染剂量（ID₅₀，~5,000 CFU）所需的 10⁷ CFU/mL 的菌血症阈值。计算小鼠安乐死时脾脏和血液滴度的比值发现，两个 Δcaf突变株的脾脏与血液 CFU 比值中位数比 WT 和 Δcaf1-comp 菌株高 2 个对数以上。
4. WT 和 Δcaf鼠疫耶尔森菌向濒死鼠疫小鼠吸血跳蚤传播的比较：让未感染的雌性印鼠客蚤吸食濒死期感染 WT 或 Δcaf突变株的小鼠血液。结果显示，吸食感染 Δcaf突变株小鼠血液的跳蚤，多数摄入的细菌量低于 ID₅₀剂量；而吸食感染 WT 菌株小鼠血液的跳蚤，多数摄入的细菌量远高于 ID₅₀剂量。跳蚤摄入的 WT 和突变株细菌数量与小鼠的全身菌血症水平直接相关，且比较跳蚤摄入细菌的观察值与预期值（根据小鼠菌血症水平和跳蚤吸血量计算）发现，感染 Δcaf突变株的小鼠吸血跳蚤与感染 WT 菌株的小鼠吸血跳蚤的观察值与预期值比值无显著差异，表明 Δcaf突变株进入真皮毛细血管的能力未受损害。

讨论

鼠疫耶尔森菌的跳蚤传播循环依赖于在哺乳动物宿主中发展出高密度菌血症。早期研究发现，要感染跳蚤，需让跳蚤在感染啮齿动物濒死期吸血，且菌血症水平至少达到 10⁷ Y. pestis/mL，跳蚤才可能感染。后续研究也证实，对于吸食小血量（<0.5μL）的跳蚤，10⁷ CFU/mL 的菌血症水平是使其摄入足够数量（~5,000 CFU）鼠疫耶尔森菌以在 50% 吸血跳蚤中引起慢性消化道感染的必要条件，只有慢性感染的跳蚤才可能发展出消化道阻塞，从而高效传播给新宿主。另一种跳蚤传播机制是早期阶段传播（mass transmission），虽不需要慢性感染和阻塞，但也需要跳蚤吸食高菌血症血液。本研究使用的小鼠模型中，F1 荚膜对毒力并非必需，研究聚焦于终末期菌血症水平，以评估 F1 荚膜对从哺乳动物到跳蚤传播的影响。

在小鼠模型中，F1 阴性鼠疫耶尔森菌会在脾脏中形成比 WT 鼠疫耶尔森菌更大、更密集的聚集体或微菌落，在其他动物组织中也有类似现象。基于此，研究提出两个假设：一是 F1 阴性菌株在体内的自聚集可能导致细菌聚集簇更多地被隔离在脾脏和其他内脏器官中，进入血流的可能性降低；二是即使出现正常的全身菌血症水平，循环的 F1 阴性细菌聚集块可能因太大而难以进入真皮毛细血管床，从而无法被吸血跳蚤获取。

研究结果支持了第一个假设。感染 Δcaf鼠疫耶尔森菌的大多数小鼠在疾病终末期的全身菌血症水平显著低于感染 WT 亲本菌株的小鼠，只有少数感染 Δcaf菌株的小鼠菌血症水平能达到向吸血印鼠客蚤输送 1 个 ID₅₀所需的阈值，而 F1 阳性的 WT 和 Δcaf1-comp 菌株感染的小鼠中，60% - 70% 能超过该阈值 。此前研究因样本量小且存在特殊感染情况，未得出显著差异，本研究通过增加样本量补偿了实验中的变异性。

研究结果否定了第二个假设。如果循环的 F1 阴性细菌聚集块太大而难以进入皮肤毛细血管微脉管系统，那么吸食已知全身（心脏血液）菌血症水平血液的跳蚤中，Δcaf CFU 的观察值与预期值比值应平均小于 1。但实际上，大多数吸食终末期疾病小鼠血液的跳蚤，无论小鼠感染的是 WT 还是 Δcaf鼠疫耶尔森菌，观察值与预期值的中位比值都约为 1 或更大，且吸食相似全身菌血症水平小鼠血液的跳蚤，从真皮毛细血管中摄入的细菌数量相似 。少数跳蚤组观察值与预期值比值变化较大且中位值较高，可能与小鼠全身血液滴度较低导致的抽样误差有关。

综合研究结果提出一种模型，即没有 F1 荚膜时，鼠疫耶尔森菌更倾向于被隔离在脾脏和其他感染组织中，导致疾病终末期菌血症水平降低。虽然 F1 阴性鼠疫耶尔森菌感染仍可能致命，但往往在达到最大菌血症水平之前小鼠就死亡了。因此，吸食濒死的 F1 阴性感染宿主血液的跳蚤，摄入足够细菌以进行早期阶段传播的比例较低，能发展出慢性消化道感染（生物膜依赖的阻塞传播模式所需）的跳蚤数量更少。

鼠疫在敏感动物中进展迅速，从皮肤传播部位到引流淋巴结，细菌大量繁殖形成脓肿，再进入循环系统，在脾脏和肝脏中再次繁殖，最终导致终末期高密度败血症鼠疫。不同动物对 F1 阴性菌株的死亡率不同，遗传背景起重要作用。此前研究在不同时间点检测发现，鼠疫耶尔森菌 Δcaf在不同小鼠品系脾脏中的细菌载量变化不同，本研究聚焦于疾病终末期，此时可能发生向吸血跳蚤的传播，且此前研究较少关注鼠疫耶尔森菌 Δcaf感染产生的菌血症水平。总体而言，哺乳动物宿主对 F1 阴性鼠疫耶尔森菌的易感性存在种间和种内差异，但 Δcaf鼠疫耶尔森菌的自聚集表型可能导致其在内部器官中更多隔离和终末期菌血症水平降低，这一现象可能与宿主遗传背景无关，有待未来用其他鼠疫动物模型进一步评估。

鼠疫耶尔森菌约在 1700 - 6400 年前从假结核耶尔森菌（Yersinia pseudotuberculosis）分化而来，其进化过程中积累了与跳蚤生物膜依赖阻塞和适应跳蚤传播生命周期相关的遗传变化，包括一些基因功能丧失和获得。每一个从人类遗骸中检测到的新石器时代晚期和青铜时代早期的古代鼠疫耶尔森菌菌株都含有 pFra 质粒和caf操纵子，表明产生 F1 荚膜的能力是鼠疫耶尔森菌进化早期获得的，有助于其适应跳蚤作为传播载体。

鼠疫耶尔森菌曾引发人类历史上一些最具破坏性的大流行，至今仍是潜在的流行病威胁。确定其从相对良性的肠道感染转变为通过跳蚤传播的高度侵袭性、毒力强的病原体的遗传变化，有助于揭示现存鼠疫耶尔森菌谱系的进化路径。本研究结果表明，获得caf操纵子是这一过程中的重要早期步骤。虽然 F1 荚膜在脊椎动物宿主中并非总是必需的毒力决定因素，但它能增强鼠疫耶尔森菌在宿主死亡前达到高菌血症水平的能力，这对于最大程度感染跳蚤、提高跳蚤早期阶段传播和生物膜依赖传播的效率至关重要。