结核分枝杆菌中 FtsB 与 PerM 通过特定螺旋相互作用调控细胞分裂的研究及潜在治疗意义

本文通过结构预测、分子动力学模拟和荧光显微镜技术，研究结核分枝杆菌（Mtb）中 PerM 与 FtsB 的相互作用。发现二者通过 FtsB 的 C 末端螺旋相互作用，影响彼此稳定性和细胞分裂，该作用或可成为治疗持续感染的潜在靶点，为抗结核治疗提供新思路。

　　### 研究背景
结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis，Mtb）感染约占全球人口的四分之一，多数感染发展为潜伏性结核感染（Latent Tuberculosis Infection，LTBI），这给结核病治疗和根除带来阻碍。预防 LTBI 的建立和再激活对结核病消除策略至关重要，而了解 Mtb 感染如何持续形成 LTBI，对于开发更有效的新型治疗方法意义重大。

此前研究发现，放线菌蛋白 PerM 在 pH 4.5 且含 Tween 80 的培养基中，对 Mtb 突变体生长有影响，其敲除会降低慢性小鼠感染期间的生长，并增加 β - 内酰胺抗生素敏感性。PerM 还与 Mtb 分裂体（divisome）相关，该分裂体是在细胞分裂过程中协调细胞壁重塑的蛋白质复合物，但 PerM 与分裂体成分 FtsB 是否直接相互作用尚不明确，且二者相互作用也缺乏实验结构数据。

近年来，蛋白质结构预测、低温电子显微镜（Cryogenic Electron Microscopy，Cryo - EM）和分子动力学（Molecular Dynamics，MD）模拟等技术的发展，为研究革兰氏阴性菌分裂体的分子结构和调控机制提供了新途径，但仍需实验验证。在本研究中，科研人员结合结构预测、MD 和荧光显微镜技术，对 Mtb 中 PerM 和 FtsB 蛋白间的预测相互作用展开研究。

研究方法

1. 结构预测：运用 ColabFold 预测蛋白质复合物结构，通过 MMseqs2 进行多序列比对，使用 AlphaFold - Multimer 获取相关结构，利用 PyMOL 进行结构可视化及相关计算。
2. 序列分析：借助 Clustal Omega 生成多序列比对，通过 Biotite 进行可视化；运用 DeepTMHMM 预测跨膜螺旋位置，使用 Logomaker 计算并绘制氨基酸频率和序列 logo。
3. 分子动力学：利用 CHARMM - GUI Membrane Builder 构建 MD 系统，选用 CHARMM36m 力场等参数，通过 OpenMM 进行模拟。不同系统在脂质比例、模拟阶段和时间步长等方面存在差异，使用 MDAnalysis 进行轨迹分析。
4. 大肠杆菌（Escherichia coli，E. coli）菌株构建：将 Mtb 的 PerM 和 FtsB 等蛋白与荧光蛋白融合表达，对序列进行密码子优化，构建相应质粒并转化到 E. coli MG1655 菌株中，在特定培养基中培养并进行诱导表达。
5. 荧光显微镜：在 Leica DMI6000 倒置显微镜上进行成像，使用不同滤光片组检测荧光，制备琼脂糖凝胶垫样品，控制培养条件和成像参数获取数据。
6. 荧光相关分析：采用 Omnipose 对明场图像进行分割，通过形态学处理和图像对齐，估计背景强度后进行荧光强度比较，使用混合线性模型分析数据。
7. 直接观察 FtsB 依赖的 PerMⁿ¹ - mNeonGreen 降解：培养相关菌株，收集细胞并裂解，通过 SDS 电泳分离蛋白质，利用 iBright FL1500 检测荧光信号，评估 PerMⁿ¹ - mNeonGreen 的降解程度。
8. 推断扩散系数分布：使用 TrackMate 提取单分子轨迹，通过 DogDetector 和 SimpleSpareseLAPTracker 进行检测和跟踪，运用 SASPT 推断扩散系数和定位误差的后验分布，并对参数进行敏感性检验。

研究结果

1. PerM - FtsB 相互作用的结构预测和分子动力学：初步结构预测显示，Mtb PerM 和 FtsB 之间存在高置信度的相互作用。MD 模拟表明，FtsB 的 C 末端螺旋（FtsB^H）与 PerM 周质面的特定口袋相互作用，且该相互作用在模拟过程中持续存在。同时发现，FtsB 能稳定 PerM，单体 PerM 模拟的最终构象与预测结构差异较大，而 PerM - FtsB 模拟的最终构象差异较小。通过对不同放线菌物种的分析，发现 FtsB^H高度保守，且在各物种中 PerM 与 FtsB^H均存在预测相互作用。进一步研究发现，PerM - FtsB 结合界面存在一些在结构预测中未观察到的氢键，且结合口袋在 MD 过程中发生变化，围绕 FtsB^H和 FtsB W186 收紧。
2. 荧光标记的 FtsB 和 PerM 在 E. coli 中的转基因表达：构建了多种 FtsB 和 PerM 的荧光融合蛋白变体，在 E. coli 中进行表达。删除 FtsB^LQ区域（预测与 FtsL 和 FtsQ 结合的区域）可增加膜定位 FtsB 的水平，表明该区域可能影响 FtsB 在缺乏 FtsL 和 FtsQ 时的稳定性。最初构建 N - 或 C - 末端标记的 mNeonGreen - PerM 均失败，通过对序列的分析和改造，构建了 PerMⁿ¹ - mNG，其荧光蛋白表达量显著提高，但膜定位较弱。在共表达实验中，意外发现相邻微菌落中失去表达 mTq2 - FtsB 质粒的菌落，其 PerMⁿ¹ - mNG 膜定位明显降低，暗示 FtsB 对 PerM 在 E. coli 膜中的稳定性有重要作用。
3. FtsB 通过 FtsB^H稳定 E. coli 膜中的 PerM：共表达 mNeonGreen 和 mTurquoise2 标记的构建体，对 E. coli 微菌落进行荧光分析。结果表明，相对于参考条件（PerMⁿ¹和 FtsB^???LQ，10 nM ATc），无诱导时 mTq2 - FtsB^???LQ蛋白表达降低 89% ；而 PerMⁿ¹ - mNG 荧光在无 mTq2 - FtsB^???LQ诱导时降低 13.3%，当 FtsB^???LQ替换为 FtsB^???LQ???H时降低 23.5%。通过量化空间相关性发现，该方法比荧光强度更能灵敏地反映 PerMⁿ¹mNG 的稳定性。在参考条件下，mNeonGreen 和 mTurquoise2 荧光的相关性较高，而其他条件下相关性显著降低，进一步证实 FtsB 通过 FtsB^H增加 PerM 在 E. coli 中的稳定性。
4. 单分子 FtsB 追踪揭示 FtsB^H依赖的 PerM 结合：构建 mEos3.2 标记的 FtsB^???LQ和 FtsB^???LQ???H变体，与 PerMⁿ¹ - mNG 或 Pf3 - mNG 共表达，进行单分子追踪实验。利用 SASPT 推断扩散系数分布，结果显示 FtsB^???LQ与 PerM 结合时扩散明显减慢，而 FtsB^???LQ???H（缺失 FtsB^H）的扩散系数相对较大。这表明 FtsB 与 PerM 的相互作用依赖于 FtsB^H，且该相互作用足够长寿命，能够显著影响 FtsB 的扩散。
5. PerM - FtsB 相互作用可能限制 Mtb 分裂体的构象灵活性：进行 MD 模拟，比较含有不同截断形式 FtsB（FtsB²⁰⁵和 FtsB¹⁸⁵，分别去除不确定的 C 末端残基和 FtsB^H）的分裂体构建体。通过分析 PbpB 转肽酶结构域相对于 FtsW 的倾斜角度发现，当存在 PerM - FtsB 相互作用（FtsB^???C模拟）时，PbpB 有 19.2° 的倾斜；而失去该相互作用（FtsB^???C???H模拟）时，倾斜角度恢复到接近预测结构的值。这表明 PerM - FtsB 相互作用可能限制 Mtb 分裂体的构象，影响其功能。

研究讨论

本研究整合荧光显微镜和分子动力学技术，从蛋白质复合物的预测结构出发，证实 FtsB^H直接介导 PerM - FtsB 结合，且该相互作用不仅稳定 FtsB，还可能影响 Mtb 核心分裂体的结构。未来需进一步研究 FtsB 是否在分枝杆菌中也能稳定 PerM，以及能否靶向该相互作用来干扰细胞分裂调控。

该研究方法可应用于其他预测的蛋白质 - 蛋白质相互作用研究。例如，Mtb 中与 PerM 位于同一操纵子的 Rv0954，虽已发现其与伸长体（elongasome）成分存在相互作用，但尚未明确其功能，可采用类似方法进行研究。

研究还发现，PerM 中靠近 FtsB^H的一些残基可能参与整合环境应激信号，如埋藏的组氨酸残基可能对 Mg^{2 +}依赖的表型有影响，蛋氨酸残基可能对氧化敏感，膜表面的组氨酸残基可能使 PerM - FtsB 相互作用对 pH 敏感，且脂质可穿透 PerM 并与 FtsB 相互作用，提示双层膜组成可能直接影响该相互作用。

在实验系统中，在 E. coli 中表达 Mtb 的 PerM 和 FtsB，表明二者结合可能不依赖于分枝杆菌特有的磷酸化或其他翻译后修饰。虽单分子追踪实验不易扩展到高通量研究，但可基于预测复合物结构开发 FRET 相互作用报告基因来探索 PerM - FtsB 及其他 Mtb 蛋白质 - 蛋白质相互作用。同时，在 E. coli 中工程化改善膜蛋白表达的方法，也有待应用于其他 Mtb 膜蛋白研究。

然而，本研究也存在局限性。在替代系统中研究相互作用，结果不能直接外推到 Mtb，需在 Mtb 中进一步验证。MD 模拟省略了分裂体成分中可能具有功能的末端残基，一些未预测到的相互作用也不能排除。例如，未预测到膜中特定的 FtsB - PerM 界面，可通过构建嵌合体进一步研究。此外，根据本研究结果预测，在 Mtb 或耻垢分枝杆菌（Mycolicibacterium smegmatis）周质中过表达 FtsB^H，可能通过竞争性抑制 PerM - FtsB 相互作用产生 PerM 缺失表型，这也有待实验验证。

最后，结合铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）分裂体的 Cryo - EM 结构研究结果，PerM 可能通过将 PbpB 限制在相对低转肽酶活性的构象来降低分裂体活性，这看似与 PerM 在某些条件下对 Mtb 和耻垢分枝杆菌的必要性相矛盾。但如果 PerM 既能促进 FtsB 稳定性（可通过 FtsB 过表达绕过），又在调节分裂体活性中发挥条件性必要作用，这一矛盾即可得到解释，且后者可能有助于 Mtb 的持续感染。