揭秘单纯疱疹病毒 1 型：包膜糖蛋白 C 如何 “护驾” 糖蛋白 D 逃避免疫攻击

单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）严重危害人类健康且尚无疫苗和治愈方法。本文研究发现，HSV-1 包膜糖蛋白 C（gC）能保护糖蛋白 D（gD）免受中和抗体影响，这一机制有助于病毒逃避免疫检测，为深入了解 HSV-1 免疫逃逸策略提供关键依据。

　　

引言

单纯疱疹病毒 1 型（Herpes simplex virus 1，HSV-1）在全球范围内广泛传播，人群感染率达 67%-79%。它可引发口腔或生殖器反复性病变，还可能导致脑炎、失明等严重后果，且感染后会终身潜伏，目前尚无疫苗和治愈方法。HSV-1 能长期存在，部分原因是其具备多种免疫逃避策略。

HSV-1 糖蛋白 C（glycoprotein C，gC）是一种多功能的 I 型膜糖蛋白，由 511 个氨基酸组成，存在于病毒包膜和感染细胞表面，仅在 α 疱疹病毒中特异性存在。gC 在病毒入侵宿主细胞过程中发挥作用，同时参与免疫逃逸，也是 HSV 疫苗研发的重点关注对象。此前研究发现，病毒粒子 gC 可保护糖蛋白 B（gB）免受抗体介导的中和作用，而本文聚焦于 gC 对 HSV 受体结合包膜蛋白 gD 的保护能力。

HSV-1 糖蛋白 D（glycoprotein D，gD）是由 369 个氨基酸构成的 I 型包膜糖蛋白。宿主细胞受体 nectin-1 和 HVEM 可与 gD 胞外域 C 末端附近的重叠但不同位点结合。gD 与受体结合后，会引发 C 末端延伸运动，暴露核心上的受体接触位点，进而通过促进与 gH/gL 的相互作用启动膜融合级联反应。gD 是中和抗体的主要靶标，也是疫苗开发的关键靶点，针对 gD 的单克隆抗体（monoclonal antibodies，MAbs）可通过阻止 gD 与宿主细胞受体结合或阻断膜融合来抑制 HSV-1 进入细胞。本研究旨在探究 gC 是否能保护 gD 免受中和抗体识别，揭示 HSV-1 独特的免疫保护机制。

结果

1. gC 缺失使 HSV-1 对 gD 抗体中和更敏感：研究人员选用一组针对 gD 不同表位和功能的小鼠抗 gD 单克隆抗体，对 Vero 细胞进行实验。实验中，对这些单克隆抗体进行 2 倍系列稀释，浓度范围为 2μg/mL 至 9.76×10^-6μg/mL。将 HSV-1 gCR（野生型重组病毒）和 ΔgC（gC 缺失突变病毒）分别与不同浓度的单克隆抗体孵育，以感染性降低 > 50% 定义为 HSV-1 被中和。结果显示，HSV-1 ΔgC 对单克隆抗体中和更为敏感，相较于 HSV-1 gCR，其敏感度差异在 2 - 16 倍之间。例如，阻断 gD 与 HVEM 相互作用的 MAb 1D3，中和 ΔgC 的浓度为 3.9×10^-3μg/mL，而中和 gCR 则需 0.125μg/mL，浓度相差 16 倍；阻断 gD 与 gH/gL 相互作用的 MAb MC5，中和 HSV-1 ΔgC 的浓度为 3.9×10^-3μg/mL，中和 gCR 的浓度为 1.5×10^-2μg/mL，相差 4 倍。阴性对照 MAb MC14 未对两种病毒产生中和作用。

在 B78-nectin-1 细胞（表达 nectin-1 受体的小鼠黑色素瘤细胞）和 B78-HVEM 细胞（表达 HVEM 受体的小鼠黑色素瘤细胞）上进行实验，也得到类似结果。在 B78-nectin-1 细胞上，MAb DL11 中和 HSV-1 ΔgC 的浓度为 1.9×10^-3μg/mL，中和 gCR 则需更高浓度；MAb MC23 中和 ΔgC 和 gCR 的浓度分别为 7.8×10^-3μg/mL 和 0.31μg/mL，相差 4 倍。在 B78-HVEM 细胞上，MAb DL11 中和 HSV-1 ΔgC 的浓度为 1.9×10^-3μg/mL，中和 gCR 需要 6.2×10^-2μg/mL，相差 32 倍；MAb 1D3 中和 ΔgC 和 gCR 的浓度分别为 3.9×10^-3μg/mL 和 1.6×10^-2μg/mL，相差 8 倍。这些数据表明，缺乏 gC 使 HSV-1 在 nectin-1 或 HVEM 介导的感染中，对 gD 单克隆抗体的中和更为敏感。2. 病毒粒子 gC 缺失增强 HSV-1 对 gD 抗体的反应性：为探究 HSV-1 ΔgC 对中和更敏感的机制，研究人员通过斑点印迹免疫分析评估 gD 单克隆抗体与 HSV-1 gCR 和 ΔgC 的抗原反应性。将病毒在天然条件下直接印迹到硝酸纤维素膜上，用抗 gD 单克隆抗体进行检测，通过荧光成像和密度测定分析结合情况。结果显示，HSV-1 ΔgC 对 gD 单克隆抗体的结合更为敏感，相较于 gCR，敏感度差异在 2.7 - 5.6 倍之间。例如，阻断 gD 与 nectin-1 相互作用的 MAb MC23，与 HSV-1 ΔgC 的结合强度比与 gCR 的结合强度高 3.1 倍；非中和性的 MAb MC14 与 ΔgC 的结合强度比与 gCR 的结合强度高 5.6 倍。这一趋势在所有测试的 gD 区域均一致，表明无论单克隆抗体的表位或功能如何，HSV-1 ΔgC 对 gD 单克隆抗体的反应性均增强。3. HSV-1 ΔgC 与 nectin-1 的结合呈野生型状态：利用病毒 ELISA（vELISA）评估 gC 对 HSV-1 粒子结合可溶性 nectin-1 受体能力的影响。将等量的 HSV-1 ΔgC、gCR 或 ΔgD（gD 缺失病毒）的 VP5（主要衣壳蛋白）固定在微量滴定板上，用多聚甲醛固定后，加入 10 倍系列稀释的 nectin-1。结果发现，nectin-1 与 HSV-1 ΔgC 的结合呈浓度依赖性，且与 HSV-1 gCR 的结合方式相似。而可溶性 nectin-1 与 HSV-1 ΔgD 的结合极少，结合率在 1.5% - 5.4% 之间，这验证了在 vELISA 中膜相关 gD 介导 nectin-1 结合的结论。综合表明，HSV-1 与 nectin-1 受体的结合与病毒粒子 gC 无关。4. 中和性抗 gD 单克隆抗体抑制 HSV-1 ΔgC 与可溶性 nectin-1 的共沉淀：研究人员进一步评估 gC 对抗 gD 抗体抑制 HSV-1 与受体结合能力的影响。将 HSV-1 ΔgC 或 gCR 与 gD 单克隆抗体预孵育，再加入可溶性 nectin-1，混合物经蔗糖梯度超速离心后，收集病毒粒子部分并印迹到硝酸纤维素膜上，检测可溶性 nectin-1 的存在。结果显示，非中和性 gD 单克隆抗体 MC14 预处理后，可溶性 nectin-1 与 HSV-1 ΔgC 和 gCR 的共沉淀未受抑制，且 MC14 增强了 nectin-1 与两种病毒的反应性。而中和性 gD 单克隆抗体 DL11 抑制了 nectin-1 与两种病毒的共沉淀，其中对 HSV-1 ΔgC 的抑制率为 51%，对 gCR 的抑制率为 37%，这与斑点印迹分析和中和实验结果一致。5. gC 缺失使 HSV-1 对可溶性 nectin-1 的抑制更敏感：通过 β - 半乳糖苷酶报告基因实验，研究重组 nectin-1 胞外域在 gC 缺失情况下阻断 HSV-1 进入细胞的能力。将 HSV-1 ΔgC 或 gCR 与可溶性 nectin-1 在 4°C 孵育 2 小时后，加入 B78-nectin-1 细胞（含有受 HSV-1 ICP4 基因启动子控制的大肠杆菌 lacZ 基因），6 小时后检测 β - 半乳糖苷酶活性。结果显示，可溶性 nectin-1 以浓度依赖的方式抑制 HSV-1 ΔgC 和 gCR 的进入，且对 HSV-1 ΔgC 进入的抑制作用更强。例如，用 1μM 可溶性 nectin-1 预处理后，HSV-1 ΔgC 的进入率降至 21%，而 HSV-1 gCR 的进入率为 48%。这表明病毒粒子 gC 使 HSV-1 对 gD 抗体和可溶性受体的抑制作用更具抗性。

讨论

HSV-1 gC 在病毒感染周期中具有多种功能，包括病毒入侵、释放和免疫逃逸。本研究证实，病毒粒子 gC 能够保护关键的受体结合蛋白 gD，使其免受中和抗体和可溶性 gD 受体的抑制，推测 gC 广泛地保护相邻的 gD 分子，包括融合和进入的重要功能域。

HSV-1 具有多种免疫保护特征，有助于其在宿主体内持续存在。例如，包膜糖蛋白 gE 与其伴侣 gI 形成高亲和力的 Fc 受体，可结合免疫球蛋白 G（IgG）抗体的 Fc 区域，阻止抗原表位识别；gC 可结合并隔离补体蛋白 C3b，防止补体激活，但抗 gC 抗体可阻断这一功能。gC 缺失的 HSV-1 对抗体介导的中和作用更敏感，主要原因是缺乏 gC 时病毒与抗体的结合增强，且 gC 还能保护 gB 和 gH/gL 免受单克隆抗体的结合和中和。这种保护作用具有特异性，gE 缺失对 HSV-1 的单克隆抗体介导的中和作用影响较小。此外，病毒粒子 gC 的缺失不影响其膜蛋白组成，说明 gC 缺失是导致 gD 特异性抗体反应性增加和病毒易感性增强的原因。

对于流感病毒、HIV 和尼帕病毒等，病毒融合蛋白的 N - 连接聚糖可保护自身抗原表位免受中和。HSV-1 融合蛋白 gB 的 N - 连接聚糖也能自我保护，抵抗抗体介导的中和作用和抗体依赖性细胞毒性。虽然 gC 不是融合蛋白，但其 N 端结构域高度糖基化，未来研究将确定 gC 上的 N - 聚糖是否能保护相邻糖蛋白，以及是否能阻断抗 gC 抗体的结合。尽管 gC 与 gD 在 HSV 粒子中距离足够近可发生化学交联，但尚未检测到它们之间的直接相互作用，可能存在低亲和力或瞬时相互作用难以捕获，同时 HSV-1 gD、gH/gL 和 gB 之间的物理相互作用也难以确定，尽管它们存在功能上的相互作用，目前关于 gC 保护相邻糖蛋白免受抗体介导中和作用的具体机制仍在研究中。

HSV-1 最初通过 gC 与细胞表面蛋白聚糖（主要是硫酸乙酰肝素）相互作用附着到宿主细胞。α 疱疹病毒以细胞特异性方式利用低 pH 内体进入途径，在进入上皮细胞的内体过程中，gC 会发生 pH 触发的变化，调节融合蛋白 gB 的构象变化和功能，同时 gC 还能增强病毒粒子从感染细胞的释放。

在实验中，gC 缺失的 HSV-1 对受体阻断抗体的中和作用更敏感，而对可溶性 nectin-1 的抑制作用更敏感，这可能部分归因于实验中温度等条件的差异。此外，尽管 gC 缺失的 HSV-1 对 nectin-1 的结合阻碍减少，但由于 gC 在其他病毒进入功能（如附着于硫酸乙酰肝素和调节 gB 融合活性）中的作用，导致其整体感染性仍降低。

本研究强调了 gC 作为一种免疫保护分子，可保护相邻的进入糖蛋白免受中和抗体的结合和作用。抗 gC 抗体可阻断病毒的免疫逃逸功能，目前一些 HSV-1 和 HSV-2 疫苗候选物包含 gC 等多种表面糖蛋白免疫原，但在活疫苗或灭活疫苗中包含 gC 可能会阻断 HSV 的内在保护特性，这为疫苗研发提供了新的思考方向。

材料和方法

1. 细胞和病毒：实验使用 Vero 细胞、表达 nectin-1 的 B78 小鼠黑色素瘤细胞（B78-nectin-1）、表达 HVEM 的 B78 小鼠黑色素瘤细胞（B78-HVEM）。这些细胞在添加 10% 胎牛血清、青霉素、链霉素和谷氨酰胺的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养，B78-nectin-1 细胞和 B78-HVEM 细胞还需定期在含有特定抗生素的培养基中筛选。实验所用病毒包括 gC 基因缺失的 HSV-1 KOS 菌株（HSV-1ΔgC2-3，简称 ΔgC）及其重组病毒（HSV-1gC2-3R，简称 gCR），以及缺乏 gD 编码序列的 HSV-1 KOS gDβ（简称 ΔgD）。细胞游离病毒通过感染 Vero 细胞制备，经多次离心和蔗糖梯度超速离心纯化后，重悬于含有 20mM HEPES 的细胞培养基中。
2. 抗体：实验使用多种抗 HSV-1 gD 小鼠单克隆抗体，如 MC23、DL11、MC14、DL6、MC5、1D3 等，这些抗体分别针对 gD 的不同结构域，由相关研究人员馈赠；H170 购自 Virusys 公司；抗 HSV-1 VP5 小鼠单克隆抗体 HA018 购自 Virusys 公司。
3. 噬斑抑制（中和）试验：将抗 gD 抗体在完全 DMEM 中进行 2 倍系列稀释，与 HSV-1 ΔgC 或 gCR（100 PFU）在 37°C 孵育 1 小时，然后将抗体 - 病毒混合物加入到培养在 24 孔板中的 Vero 细胞、B78-nectin-1 细胞或 B78-HVEM 细胞中。感染 1 小时后，更换新鲜培养基，18 - 24 小时后，用冰冷的甲醇 - 丙酮溶液固定细胞，通过免疫过氧化物酶染色检测噬斑形成情况。若噬斑形成（感染性）减少 > 50%，则认为该单克隆抗体具有中和作用。
4. 斑点印迹免疫分析：将细胞游离的 HSV-1 ΔgC 或 gCR（5×10⁶ PFU）在杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）中进行系列稀释，使用 Minifold 点印迹系统将样品印迹到硝酸纤维素膜上。用含有 5% 牛奶的 PBS - 0.2% 吐温 20 封闭缓冲液封闭膜，然后加入初级抗 HSV-1 gD 抗体在 4°C 孵育过夜，再加入与 Alexa Fluor 647 偶联的山羊抗小鼠多克隆抗体在室温孵育 30 分钟。用 Azure Biosystems c400 荧光 Western blot 成像仪对膜进行成像，并通过密度测定（ImageJ）进行量化。
5. 病毒 ELISA 检测 nectin-1 受体结合：将等量的 HSV-1 gCR、ΔgC 或 ΔgD 的 VP5 固定在 MaxiSorp 包被的微量滴定板上，室温孵育 2 小时，用 PBS 洗涤后，用 4% 多聚甲醛固定病毒。再次洗涤后，用含有 10% BSA 的 PBS 封闭孔。将可溶性 nectin-1 胞外域（含有 6x - His 标签）进行 10 倍系列稀释，从 1μM 开始，加入孔中室温孵育 2 小时。洗涤后，加入 α - 6x - Ηis - HRP 单克隆抗体（1:1000 稀释）室温孵育 1.5 小时，再洗涤后加入 2,2'- 叠氮基双（3 - 乙基苯并噻唑啉 - 6 - 磺酸）底物（ABTS），用 ELx808 微量滴定板读数器在 405nm 处读取 HRP 活性。
6. HSV-1-nectin-1 共沉淀试验：将等量的 HSV-1 ΔgC 或 gCR 与 20μg 抗 gD 单克隆抗体 MC14 或 DL11 在含有 10% BSA 的 PBS 中 37°C 孵育 1 小时，加入 15μg 可溶性 nectin-1 后在 4°C 孵育 2 小时。将样品加到 60% - 30% - 10% 蔗糖 / PBS 梯度上，用 SW32 Ti 转子在 16,000×g 下离心 4.5 小时，收集 60% - 30% 蔗糖界面的病毒带，印迹到硝酸纤维素膜上。用封闭缓冲液处理膜后，加入与 CoraLite Plus 647 偶联的抗 6x - His 抗体室温孵育 1.5 小时，用 Azure Biosystems c400 荧光 Western blot 成像仪成像并通过密度测定（ImageJ）量化。
7. 测定病毒制剂中 HSV-1 VP5 含量：为保证在 vELISA 或共沉淀实验中不同病毒的等量加载，先通过 SDS - PAGE 和 Western blot 分析 HSV-1 gCR、ΔgC 或 ΔgD 的 VP5 含量，用抗 HSV-1 VP5 抗体 HA01