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本文聚焦类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei），研究发现该菌临床分离株中 amrR 基因的新型部分缺失与美罗培南（MEM）耐药相关。通过构建突变株及实验验证，揭示其耐药机制，为类鼻疽治疗和防控提供关键依据，对提升治疗策略意义重大。
### 引言
类鼻疽是一种由类鼻疽伯克霍尔德菌（
Burkholderia pseudomallei）引起的热带疾病，主要通过接种、摄入和吸入传播，在东南亚和澳大利亚北部流行，全球每年约有 165,000 例病例和 89,000 例死亡。该菌对多种抗生素具有固有耐药性，治疗需采用双相疗法，即便如此，泰国的死亡率仍高达 25%-40%。
类鼻疽伯克霍尔德菌的耐药机制包括酶失活、靶位点改变和外排泵机制等。其中，部分菌株对美罗培南和复方新诺明（SXT）耐药与外排泵有关。研究发现，AmrAB-OprA 外排泵属于耐药结节分化（RND）外排泵，由膜融合蛋白（MFP）、RND 转运蛋白和外膜蛋白（OMP）组成，分别由amrA（BPSL1804）、amrB（BPSL1803）和oprA（BPSL1802）编码，其调节基因amrR（BPSL1805）位于amrAB-oprA操纵子上游。
此前研究分析了 1,317 株泰国东北部患者的临床类鼻疽伯克霍尔德菌分离株全基因组，鉴定出 3 株美罗培南低敏感（MEM-LS）菌株（DR10212A、DR90049A 和 DR90031E），它们存在amrR基因的部分缺失突变。本研究旨在通过诱变和定量逆转录实时聚合酶链反应（RT-qPCR），探究这些突变在降低美罗培南敏感性中的作用。
材料和方法
- 生物安全批准：本研究获得了玛希隆大学热带医学学院机构生物安全委员会的批准（MU 2022–031）。
- 类鼻疽伯克霍尔德菌分离株：从泰国东北部九家医院 2015 年 7 月至 2018 年 12 月收集的 1,317 株临床分离株中，选取 3 株 MEM-LS 菌株（DR10212A、DR90049A 和 DR90031E）。通过 Ashdown 琼脂上的典型菌落形态、乳胶凝集试验、基于 TTS1 的 RT-PCR 和全基因组测序鉴定为类鼻疽伯克霍尔德菌，所有菌株在玛希隆大学热带医学学院生物安全 3 级（BSL-3）实验室培养。
- 抗生素敏感性测定：采用肉汤微量稀释法（BMD）测定阿莫西林克拉维酸（AMC）、头孢他啶（CAZ）、美罗培南和 SXT 对类鼻疽伯克霍尔德菌分离株的最低抑菌浓度（MIC）。根据临床和实验室标准协会（CLSI）指南准备抗生素浓度范围，按照欧盟药敏试验委员会（EUCAST）标准判断美罗培南敏感性，MIC > 2 μg/mL 为 MEM-LS 菌株。
- amrR 突变株和互补菌株的构建：利用 pEXKm5 质粒替换法，将参考菌株 K96243 的amrR基因序列（K96243-amrR）导入 DR10212A、DR90049A 和 DR90031E 菌株中，构建互补菌株。通过 PCR、Sanger 测序和全基因组测序验证互补菌株的正确性，并比较亲本菌株和互补菌株对 AMC、CAZ、美罗培南和 SXT 的抗生素敏感性。
- DNA 提取和 Sanger 测序：使用 QIAamp DNA Mini Kit 提取类鼻疽伯克霍尔德菌过夜培养物的基因组 DNA，用 NanoDrop Lite 分光光度计测定浓度，琼脂糖凝胶电泳评估质量。用设计的引物对互补菌株的amrR插入序列进行 Sanger 测序。
- 全基因组测序和分析：对三对亲本和互补菌株进行全基因组测序（WGS），验证互补菌株的正确性。提取 DNA 后，进行 150 碱基读长文库制备，用 Illumina Hiseq2000 系统测序。使用 Velvet v.1.2.10 进行从头组装，CheckM v.1.2.2 评估基因组完整性和污染，QUAST v.5.0.2 评估 contigs 数量和 N50，Snippy v.4.6 确定基因组变异。
- RNA 提取和转录本定量：将类鼻疽伯克霍尔德菌在 LB 肉汤中富集培养，再培养至对数中期，用 TRIzol 试剂提取 RNA，经 RNase-Free DNase 处理后测定浓度。采用两步 RT-qPCR 评估oprA、amrB和amrA基因的表达水平，以 16S rRNA 为内参基因，用 2-ΔCT方法计算基因表达水平，通过 Student’s t 检验比较 MEM-LS 亲本菌株和相应 MEM 敏感突变株的表达差异，P < 0.05 为有统计学意义。
结果
- 用野生型 K96243 amrR 片段互补 MEM-LS 分离株：与参考菌株 K96243 相比，DR10212A、DR90049A 和 DR90031E 菌株的amrR基因分别存在 V197del、A202_R207del 和 H92_S154del 突变。通过等位基因置换诱变，成功将 K96243-amrR片段插入三株 MEM-LS 菌株，构建了互补突变株。PCR 和测序结果证实了互补菌株构建成功。
- K96243-amrR 互补突变株对美罗培南更敏感：测定互补菌株的美罗培南 MIC 并与亲本菌株比较，发现 DR90049A∷K96243-amrR和 DR90031E∷K96243-amrR的美罗培南 MIC 从 4 μg/mL 降至 1 μg/mL，变为美罗培南敏感菌株；DR10212A∷K96243-amrR的美罗培南 MIC 从 16 μg/mL 降至 4 μg/mL，但仍为 MEM-LS 菌株。互补菌株对 AMC、CAZ 和 SXT 的 MIC 无显著变化，表明amrR区域的缺失突变可能是 MEM-LS 表型的潜在原因。
- amrR 部分缺失增强 amrAB-oprA 外排泵基因的转录：检测亲本菌株和互补菌株中oprA、amrB和amrA基因的表达水平，发现互补菌株中这些基因的表达均显著下调。例如，互补菌株中oprA基因表达至少降低 5 倍，amrB基因降低 10 倍，amrA基因降低 11 倍，说明amrR基因的特定突变导致amrAB-oprA外排泵转录水平上调，与美罗培南耐药相关。
讨论
本研究通过诱变、MIC 测试和 RT-qPCR 证实，类鼻疽伯克霍尔德菌临床分离株中amrR基因的部分缺失与amrAB-oprA外排泵基因上调和美罗培南耐药有关。RND 操纵子在amrR调控下形成的复合物能将抗菌化合物泵出细菌细胞。部分 MEM-LS 菌株互补后美罗培南 MIC 变化，表明amrR基因改变影响美罗培南敏感性，但 DR10212A∷K96243-amrR仍为 MEM-LS 菌株，可能存在其他耐药因素，如penA突变。
此前报道澳大利亚分离株中amrR的多种突变可导致美罗培南耐药，本研究菌株中未发现这些突变，说明不同地区amrR基因突变位点不同，但都可能是美罗培南耐药的潜在因素。本研究还发现，DR10212A 对 CAZ 耐药与penA基因的 P167S 突变有关，SXT 耐药机制可能与amrR无关，需进一步研究。
此外，临床类鼻疽伯克霍尔德菌美罗培南耐药的进化机制尚不清楚，可能与抗生素治疗期间暴露于亚最佳或短期抗生素有关。部分患者反复感染，其分离株美罗培南敏感性发生变化，提示长期抗生素暴露可能导致美罗培南耐药。类鼻疽伯克霍尔德菌在宿主内的持续存在和突变会导致复发感染、增强毒力和产生耐药性。本研究揭示了美罗培南耐药的遗传机制，强调了长期监测临床分离株和预防复发感染的重要性，为改进类鼻疽的诊断、治疗和公共卫生策略提供了基础。但amrR基因缺失影响amrAB-oprA外排泵表达的分子机制仍需进一步验证，如功能测定或相互作用研究等。
