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本文聚焦 A 群链球菌（GAS）感染，通过对意大利一大学医院 2018 - 2024 年数据的研究，发现疫情后 GAS 感染显著增加且更严重。基因组分析揭示多种序列类型，包括新兴的 M1UK谱系。研究强调持续监测和防控的重要性，为应对 GAS 感染提供关键依据。
### 研究背景
A 群链球菌（Streptococcus pyogenes，GAS）是一种仅在人类中传播的窄谱病原体，主要通过呼吸道飞沫或直接接触传播。它能引发多种感染，从非侵袭性的咽炎、脓疱病，到危及生命的侵袭性感染，如败血症、脑膜炎等。2014 年起，英国出现 GAS 感染增加的情况，主要与 M1
UK谱系的传播有关，该谱系增强了猩红热毒素 SpeA 的表达。在新冠疫情期间，GAS 感染有所减少，但随着疫情防控措施的放松，欧洲多个国家报告 GAS 病例显著增加。意大利伦巴第地区自 2022 年春季开始逐步放宽防控措施，本研究所在的意大利北部某大学医院也观察到 GAS 感染的急剧增加，因此开展此项研究，旨在评估疫情后 GAS 感染激增的潜在因素。
材料和方法
- 研究设置与人群：收集 2018 年 6 月至 2024 年 6 月意大利瓦雷泽大学医院所有确诊 GAS 感染的医疗报告。该医院微生物实验室服务约 50 万城乡混合人口，样本来自住院和社区患者。研究未收集详细临床数据，如宿主状态、合并症、治疗方法和结果等。研究将 GAS 感染分为轻度（耳、生殖器、口咽样本）、中度（脓肿、眼、脓液、呼吸道样本、皮肤、尿液、伤口样本）和侵袭性（血液、脑脊液和其他无菌体液样本）三个严重程度级别，排除 3 个月内同一患者重复分离的菌株。
- 细菌鉴定与储存：采用 MALDI - ToF MS（VITEK - MS，bioMérieux）鉴定细菌分离株。自 2022 年末文献报道 GAS 病例激增后，密切监测本中心的 GAS 检测率，并将侵袭性菌株储存在 - 80°C 以备进一步分析。从 2023 年 5 月至 2024 年 1 月的 128 株 GAS 分离株中选取 35 株进行全基因组测序（WGS），后因 1 株受污染排除，最终对 34 株进行测序，包括 15 株侵袭性 GAS 分离株、8 株中度感染和 11 株轻度感染分离株，其中 4 株来自已知家族聚集性感染。
- 基因组 DNA 纯化与测序：细菌培养至对数生长后期（OD590为 1），用基于棉子糖的方法纯化高分子量基因组 DNA，并用 Qubit dsDNA BR Assay Kit（Thermo Fisher Scientific）定量。采用 Illumina 和 Nanopore 两种测序技术进行 WGS，Illumina 在 NextSeq 550 设备上使用 NextSeq 500/550 v2.5 Kit（300 cycles）进行 2 × 150 bp 双端测序；Nanopore 测序按已报道方法进行，用 0.5 体积的 AMPure XP beads（Beckman Coulter）进行 DNA 大小选择，用 SQK - RBK 114.96 kit（Oxford Nanopore Technologies）构建文库，在 GridION X5 设备上使用 R10.4.1 流动池（FLO - MIN114）测序，用 Guppy high accuracy mode v7.1.4 进行实时碱基识别，过滤掉质量低于 Q9 的 reads。
- 基因组组装与分析：用 FastQC v0.11.5 分析 Illumina reads，用 Trimmomatic v0.39 进行修剪；用 NanoPlot v1.42.0 分析 Nanopore reads，用 Filtlong v0.2.1 软件过滤获得 30× 覆盖度，以 1.8 Mb 估计基因组大小，用 Flye v2.9.3 - b1797 进行组装，用 Medaka v1.11.3 和 Pilon v1.24 对组装结果进行抛光，用 Bandage v0.8.1 评估组装完整性，用 Ideel 和 CheckM v1.1.3 评估组装质量，用 NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline（PGAP）v6.7 自动注释组装基因组。用 ICEfinder 和 PHASTER 分别检测基因组中整合和结合元件（ICEs）、整合和可移动元件（IMEs）以及前噬菌体的存在；用 ResFinder 检测获得性抗菌耐药基因，通过与参考菌株 SF370 的 Clustal Ω 比对分析 GyrA 和 ParC 蛋白中与氟喹诺酮耐药相关的氨基酸替换。用 PopPUNK tool v2.6.5 评估菌株的遗传相关性，以 S. pyogenes 菌株 SF370（GenBank accession number AE004092）的完整基因组为外群构建系统发育树，WGS 数据已存入 NCBI 的 BioProject no. PRJNA1070447。
- 统计分析与流行病学分布：用 JASP（Version 0.19.0）和 RStudio（Version 2024.4.2.764）中的 ggstatsplot、ggplot2、tidiverse 等包进行列联表和 χ2 检验；用 RStudio 中的 incidence 包绘制流行病学曲线，将同一月份的所有 GAS 病例合并统计；用 ggpubr 包中的 ggballoonplot 函数绘制按严重程度划分的不同月份病例分布气球图；用 RawGraphs 2.0 创建 2023 年 5 月至 2024 年 1 月 GAS 病例分布气泡图。用 Welch’s t - test 比较两组（女性和男性）的平均年龄，用 Welch’s one - way ANOVA 检验比较三个严重程度层（轻度、中度和侵袭性 GAS 感染）的平均年龄，用 Games - Howell post hoc test 比较组间差异组合，用 χ2 检验分析分类变量分布，P 值≤0.05 认为有统计学意义，用 InkScape software v1.3.2 处理图像。
研究结果
- 六年 GAS 感染的流行病学追踪：2018 年 6 月至 2024 年 6 月，共记录 531 例实验室确诊的 GAS 感染病例，来自 510 名患者。其中，轻度感染 398 例（75%），中度感染 99 例（18.6%），侵袭性感染 34 例（6.4%）。感染严重程度与年龄显著相关，老年患者分离出的 GAS 更常与严重感染相关。510 名患者中，女性 249 人（48.9%），男性 261 人（51.1%），女性患者年龄显著大于男性，但性别与感染严重程度无显著差异。GAS 病例在六年内分布不均，2018 年中至 2022 年中，仅 116 例（21.8%），而 2022 年 6 月至 2024 年 5 月，有 415 例（78.2%）。同时，感染严重程度也发生显著变化，2022 年中期前，116 例感染中，轻度占 87.1%，中度占 12.1%，侵袭性仅占 0.8%；之后，415 例感染中，轻度占 71.6%，中度占 20.5%，侵袭性占 7.9%。此外，研究还发现两个季节性高峰，多数轻度病例发生在冬季和春季，夏季病例减少，但 2022 - 2024 年期间，中度和侵袭性感染在夏季相对增加，如 2022 - 2024 年 7 月和 8 月，中度病例分别占 42.8% 和 29.4%，9 月侵袭性病例占近一半（41.7%）。
- 不同 emm 类型的流行病学及 M1 亚谱系分析：对 2023 年 5 月至 2024 年 1 月的 34 株 GAS 分离株进行测序分析，发现 GAS 基因组大小相当保守，平均长度 1,840 kb（SD 61.1 kb），与分离来源和严重程度无关。共鉴定出 11 种不同的 emm 类型，部分序列类型（ST）与 emm 类型有明确对应关系，如 ST28 对应 emm1，ST36 对应 emm12 等。15 株侵袭性 GAS 分离株中，6 株属于 ST28（emm1），但 emm 类型与感染严重程度无显著差异。感染 emm1 GAS 的患者年龄显著大于感染其他谱系的患者。多数 emm1 分离株属于新兴的 M1UK谱系，仅有 1 株属于 M113SNPs亚谱系，且所有 ST28 emm1 基因组在转录调节因子 rofA 基因中均观察到一个同义替换（C650T）。
- “疫情后” GAS 分离株的系统发育结构：对 34 株测序的 GAS 分离株进行系统发育分析，发现它们分为两个主要分支，一个更保守，包含所有 ST28/emm1 分离株（包括参考 M1 GAS 分离株 SF370），另一个更具异质性，包含其余分离株。9 株 ST28 基因组在核心基因组内显示出不同程度的保守性，其中 7 株高度相似，而 2 株引起侵袭性感染的 ST28 基因组（#20 和 #24）差异较大。25 株非 ST28/emm1 分离株则聚类为 10 个 ST 特异性分支，如 4 株 ST36/emm12 分离株来自先前描述的家族爆发，基因组序列无差异，在系统发育树中合并为一个分支。
- “疫情后” GAS 的基因组特征：荚膜操纵子、移动遗传元件和抗菌耐药基因：34 株测序的 GAS 分离株中，多数（27/34，79.4%）存在 hasABC 操纵子编码的荚膜生物合成簇，但 ST101/emm89、ST39/emm4 和 ST46/emm22 克隆无此簇。1 株引起脑脊液感染的分离株（#28）表现出高度黏液表型，其荚膜操纵子上游存在插入序列 IS1239 且方向相反。在 34 个分析基因组中，共鉴定出 39 种不同的前噬菌体、3 种整合结合元件（ICEs）和 3 种整合可移动元件（IMEs），它们与抗菌敏感性模式和感染严重程度无特定相关性。其中 23 种前噬菌体已被表征，包括 4 种卫星前噬菌体，16 种为新发现的前噬菌体；ICEs 和 IMEs 多为未表征或新的复合结构。部分分离株携带抗菌耐药基因，如 ST403 分离株 #18 和 #27 携带含多个耐药决定子的新型复合 ICE，即 ICEGAS18.1；分离株 #26 也携带含耐药决定子的复合 ICE。此外，2 株分离株（#28 和 #30）对喹诺酮耐药，虽无获得性耐药基因，但 parC 基因存在突变。
讨论
自 2015 年起，全球 GAS 感染模式和严重程度发生显著变化，M1UK谱系的传播起到重要作用。意大利自 2022 年中期也观察到 GAS 感染的重新出现。本研究六年的流行病学追踪显示，GAS 感染在疫情后显著增加，且中度和侵袭性感染增多，iGAS 病例的增加部分归因于 emm1，但也可能与宿主易感性增加有关。对 34 株分离株的测序虽有地理、时间和数量限制，但表明 emm1 在 iGAS 病例中占比较高，M1UK谱系导致了部分 iGAS 感染。同时，研究还发现 GAS 感染的季节性趋势，年龄与感染严重程度相关，以及部分菌株的抗菌耐药情况。
然而，本研究存在一定局限性。首先，感染的三层分组（轻度 / 中度 /iGAS）与传统二分法（iGAS / 非 iGAS）不同，可能存在更高的误分类可能性，但合并轻度和中度结果作为非 iGAS 时，结论仍稳健。其次，测序分离株虽考虑了患者年龄、性别和严重程度，但因疫情前病例少、疫情期间实际限制和疫情后检测及测序滞后，未对 2023 年前的分离株进行测序。最后，研究仅纳入人口统计学数据，未考虑宿主免疫和共感染等因素。此外，疫情期间轻度病例可能因医疗就诊减少而漏报。
综合临床微生物学、流行病学分析和基因组学，本研究证实了 S. pyogenes 的近期激增，并尝试梳理其潜在因素，包括宿主相关（如年龄、性别）、病原体相关（如 emm 类型、抗菌耐药性、毒力因子）和外部（如新冠疫情防控措施的影响、季节性变化）因素。除 M1UK谱系的兴起外，其他因素也值得进一步研究，这也凸显了建立欧洲和 / 或全球 GAS 网络的必要性。
