基于 c-MYC 启动子序列的 Pu22 G - 四链体与抗肿瘤吖啶衍生物的相互作用：NMR/MD 联合研究

本文通过光谱和计算分析，研究了 c-MYC NHE III1代表性 G - 四链体 Pu22 与两种有前景的双吖啶（C-2045、C-2053）及其单体（C-1311、C-1748）的相互作用机制，为以 c-MYC 为靶点的治疗药物开发提供了重要依据。

　　### 引言
不对称双吖啶（UAs）是一类新型抗癌化合物，对多种癌细胞系和实体瘤具有显著的抗肿瘤活性。其作用机制和分子靶点仍在深入研究中，近期发现 UAs 可抑制 c-MYC 原癌基因，该基因在许多肿瘤类型中过度表达。

c-MYC 是 MYC 基因家族的重要成员，编码 c-MYC 转录因子。其启动子区域的核酸酶超敏感元件 III₁（NHE III₁），又称 Pu27，富含鸟嘌呤（G），在生理条件下，其双链 DNA 形式与单链 DNA G - 四链体（G4）共存。G4 结构的形成与多种关键细胞过程相关，可通过与小分子药物结合并稳定其结构来调节 c-MYC 表达。

UAs 由两个不同的吖啶基环系统通过氨基烷基连接子连接而成。理论上，这类分子可通过两个多芳香亚基与 G - 四链体相互作用。本研究使用先进的核磁共振（NMR）技术和分子建模计算，研究 UAs 与 c-MYC 启动子 G - 四链体的相互作用。为简化光谱研究并保持生物学相关性，选用了 Pu22 序列作为模型 MYC-G4 结构，该序列在 K⁺溶液中形成单一优势拓扑结构。研究目标是确定吖啶衍生物能否与 Pu22 G - 四链体形成稳定的非共价复合物，阐明复合物结构，并确定决定其与 MYC-G4 结合模式的配体结构元件。

结果

1. Pu22 G - 四链体的参考光谱：此前已报道 Pu22 的 NMR 三维结构，本研究采用之前确定的核苷酸编号。选择 pH = 5.0 的 10 mM 醋酸钾缓冲液（添加 10 mM KCl）作为 NMR 实验的标准环境，基于此对 Pu22 序列进行质子信号归属，通过 NOESY、TOCSY 和¹H-¹³C HSQC 实验完成了大部分脱氧核糖质子的归属。
2. 通过 Pu22 与吖啶衍生物滴定形成的 DNA: 配体复合物：在生理相关 pH 值下，UAs 存在三种主要质子化形式，这使得在 pH = 6 及以上进行 Pu22 复合物的 NMR 立体化学研究变得困难。因此，将 pH 降至 5.0，此时 UAs 净电荷为 +2，增强了其与带负电核酸的亲和力，减少了自缔合倾向。

用 C-2045 和 C-2053 滴定 Pu22，通过 1D ¹H NMR 监测发现，随着滴定进行，亚氨基质子共振逐渐移动，代表 3′和 5′外部 G - 四链体亚氨基质子的信号移动最大，中间四链体质子信号移动不明显但宽度改变，表明 C-2045 和 C-2053 均以 1:2 的 DNA 比例与 Pu22 相互作用，且相互作用相对特异性和较强，主要围绕 UAs 平面片段与两个外部 Pu22 G - 四链体的相互作用。

由于无法在 NOESY 光谱中获得 UAs 的共振信号或仅检测到弱的分子间相关性，利用 UAs 由两个非电子耦合芳香亚基组成的特点，使用单体类似物 C-1311 和 C-1748 进行进一步研究。实验表明，C-1748 与 Pu22 G - 四链体的相互作用较弱且非特异性，而 C-1311 与 Pu22 形成了明确的 1:2 mol/mol 非共价加合物，显著提高了 G - 四链体的热稳定性。此外，UAs 和 C-1311 能够诱导缺乏 K⁺离子溶液中的 Pu22 形成 G - 四链体。
3. Pu22:C-1311 复合物的 NMR 研究：对 Pu22:C-1311 1:2 mol/mol 复合物进行 NOESY 光谱分析，发现多个关键分子间 NOE 接触，证实两个 C-1311 配体分子分别靠近 G - 四链体的两个外部 G - 四链体。基于光谱数据构建分子模型并进行约束分子动力学（MD）模拟，得到 Pu22:C-1311 1:2 mol/mol 非共价加合物的溶液立体结构，表明 C-1311 通过占据 G - 四链体的 “药物结合口袋”，插入鸟嘌呤四链体和侧翼 DNA 侧链之间与 Pu22 结合。
4. 自由能计算：对于 Pu22 与 UAs（C-2045 和 C-2053）的复合物，无法通过 2D NMR 研究其结构。基于 C-1311 与 Pu22 形成明确复合物，而 C-1748 无特异性相互作用的事实，假设 UAs 主要通过咪唑并吖啶酮（C-1311 类似）环系统与 Pu22 的鸟嘌呤四链体相互作用。构建两个复合物的分子模型并进行 MD 研究，采用 Replica Exchange Umbrella Sampling（REUS）方法计算自由能。

自由能剖面图显示，C-2045 和 C-2053 与 Pu22 的 5′ G - 四链体相互作用的能量最小值在 5′侧更窄，表明与 5′ G - 四链体的相互作用比 3′ G - 四链体更明确。C-2045 通常与 Pu22 G - 四链体结合更强，而 C-2053 形成的相互作用更紧密。MD-US 模拟得到的结构与 NMR 研究结果一致，证实 UAs 通过咪唑并吖啶酮环系统与 Pu22 相互作用，连接子和 9 - 氨基 - 1 - 硝基吖啶部分作为配体侧链。

讨论

1. 单吖啶衍生物（C-1311 和 C-1748）
   • C-1311：C-1311 与 Pu22 G - 四链体通过咪唑并吖啶酮药效基团相互作用，两个分子分别结合到外部 G - 四链体的 5′和 3′侧。NOE 接触确定了 Symadex 分子在 “药物结合口袋” 的位置，且其侧链在复合物中取向良好，形成了宿主 / 配体氢键。C-1311 咪唑型环中的一个氮原子（N2）在 pH < 8 时质子化带正电，与外部 G - 四链体的鸟嘌呤残基 O6 原子配位，形成类似 K⁺阳离子在 G - 四链体平面间的配位结构。与其他吖啶配体不同，C-1311 与 G - 四链体的两个外部 G - 四链体都相互作用，且其侧链的正电荷增加了与 DNA 的结合亲和力，并与 Pu22 侧翼残基的糖 - 磷酸骨架形成氢键，对 G - 四链体 / 配体相互作用的强度和特异性至关重要。
   • C-1748：用 C-1748 滴定 Pu22 时，DNA 亚氨基质子化学位移变化微弱且仅涉及 5′端 G - 四链体的两个亚氨基信号，表明其与 Pu22 的 5′和 3′ G - 四链体表面亲和力较弱，可能存在的相互作用快速、不稳定且短暂。这可能与 9 - 氨基 - 1 - 硝基吖啶分子的非平面几何结构有关，其蝴蝶形立体结构导致与 Pu22 鸟嘌呤碱基缺乏强 π-π 相互作用。不过，C-1748 可能与 G - 四链体的环或 5′和 / 或 3′侧翼区域发生非特异性相互作用，但由于系统的高动态性质，无法确定其具体性质。
   
   
2. 不对称双吖啶（C-2045 和 C-2053）：Pu22 与 C-2045 和 C-2053 形成的复合物通过 G - 四链体亚氨基质子共振的逐渐移动得以证实，化学计量比为 1:2 mol/mol。但 NOESY 光谱未显示 UAs 芳香质子的相关性或相关性极弱，表明复合物中 UAs 的化学环境不稳定，不存在单一主导结构。

根据 UAs 的二聚体性质和其单体与 G - 四链体的相互作用差异，推断 UAs 可能通过咪唑并吖啶酮环系统与 Pu22 的 5′和 3′ G - 四链体结合，氨基烷基连接子和 9 - 氨基 - 1 - 硝基吖啶部分作为大侧链，与 G - 四链体的侧翼残基和环存在多种潜在相互作用。

计算结果显示，C-2045 与 G - 四链体外部 G - 四链体相互作用的能量最小值较深且宽，表明其结合不仅涉及咪唑并吖啶酮亚基与 G - 四链体的 π-π 相互作用，还包括整个分子与 Pu22 侧链的缠结。C-2053 的自由能剖面图呈现单一相对尖锐的全局最小值，对应咪唑并吖啶酮部分与外部 G - 四链体的 π-π 相互作用。C-2045 和 C-2053 结构差异在于咪唑并吖啶酮环系统 8 位的羟基，该羟基影响了分子的电子性质、极性和与 G - 四链体形成氢键的能力，导致 C-2045 结合更强但结构更灵活，C-2053 则更倾向于 π- 电子相互作用但结合稍弱。

MD-US 轨迹显示，UAs 的两个环系统参与了 π- 电子相互作用、插入 G - 四链体和侧翼残基之间、插入侧翼区域的含氮碱基残基之间、类似 Watson-Crick 碱基配对的短寿命碱基配对相互作用以及氢键形成（主要是 C-2045）。此外，UAs 的咪唑并吖啶酮环系统带正电，虽在复合物中与 C-1311 的电荷排列不同，但仍显著增强了对 G - 四链体结构的整体亲和力。

结论

实验数据表明，单吖啶衍生物 C-1311 以及不对称双吖啶 C-2045 和 C-2053 与 Pu22 G - 四链体确实存在相互作用，而 C-1748 与该序列的相互作用不强且不明确。C-1311、C-2045 和 C-2053 对 Pu22 G - 四链体有显著亲和力，相互作用性质取决于配体侧链结构以及在 Pu22 的 5′或 3′端的相互作用。配体侧链大小增加了 DNA / 配体相互作用的复杂性，反映在 NMR 实验的信号展宽和计算研究的能量最小值展宽上。

咪唑并吖啶酮药效基团是能与 MYC-G4 结构相互作用的平面分子，是抑制 c-MYC 表达的小分子药物的有力候选者。UAs 在抑制 c-MYC 表达方面具有优势，因其与双链 DNA（dsDNA）的相互作用不显著，而 C-1311 是 dsDNA 的强嵌入剂，可能影响其作为 G - 四链体选择性配体的应用，但不排除其与 G - 四链体结合在生物学活性机制中的重要性。

对不同癌细胞系的研究表明，UAs 对癌细胞的敏感性高于健康细胞，对 c-Myc 蛋白表达的影响因细胞系而异，可能通过稳定 mRNA 中的 G - 四链体抑制 c-Myc 蛋白翻译。此外，UAs 对胰腺癌细胞系的增殖有抑制作用且对健康细胞毒性较低。未来研究将聚焦于咪唑并吖啶酮侧链在与各种 G - 四链体结合中的作用，特别是侧链结构、大小和流动性的影响。

材料和方法

1. 化学试剂：C-1311、C-1748、C-2045 和 C-2053 在格但斯克理工大学化学系药物技术与生物化学系合成，Pu22 DNA G - 四链体序列购自 Metabion, GmbH，并使用 Amicon Ultra 2 mL 离心过滤器进一步纯化，所有化合物经 HPLC 分析纯度均大于 95%。
2. 样品制备：将吖啶衍生物溶解在去离子水中制备 10 mM 配体储备溶液，用于滴定 Pu22 样品。Pu22 样品用于 NMR 研究时，分别含有 4 OD（~90 μM）或 20 OD（~450 μM）DNA 材料，溶解在 pH 5.0 的 10 mM 醋酸钾缓冲液中，并添加 10 mM KCl，样品总体积为 200 μL，根据实验需求调整溶剂系统。
3. NMR 实验：在 700-MHz Brüker Avance III 光谱仪上收集光谱，使用 Brüker TopSpin 3.6.5 软件和 NMRFAM-SPARKY v1.470 套件进行处理。质子 1D NMR 光谱在 5°C 至 75°C 范围内收集，参考 NMR 光谱包括不同混合时间和溶剂系统的 NOESY、TOCSY 和 HC-HSQC 实验，采用标准方法进行共振归属，通过记录复合物的 NOESY 和 TOCSY 光谱确定 dsDNA: 配体复合物的归属和 DNA / 配体交叉峰。
4. 分子建模
   • 量子化学参数化：使用 Avogadro 软件构建 C-1311、C-2045 和 C-2053 的数值模型，用 MMFF94 力场优化初始几何结构，从 CHARMM36 广义力场获取基本参数，使用 Gaussian09 软件进一步优化，采用 Minnesota 混合泛函（MN12SX）在 6-31G?理论水平下找到最佳几何结构，通过二阶 M?ller-Plesset 微扰理论（MP2）计算部分原子电荷，用于后续模拟。
   • 模拟系统的制备：从蛋白质数据库（PDB）获取 G - 四链体的数值模型，根据 1D NMR 检查结果，在每个模拟系统中，将两个配体分子（C-1311、C-2045 或 C-2053）放置在 Pu22 G - 四链体附近，使咪唑并吖啶酮环系统靠近外部 G - 四链体，使用 VMD v1.9.4 软件构建复合物初始模型。
   • 模拟程序：将 Pu22: 配体复合物置于直径 6.2 nm 的立方盒中，在真空中最小化以找到势能函数的初始最小值，填充水（spc216 模型），再次最小化能量，添加适量钾离子和氯离子中和环境，保持两个钾离子在 Pu22 的 G - 四链体之间，最后再次最小化能量，使用 CHARMM36 力场和 GROMACS 2020.4 软件包结合 PLUMED 2.6.2 插件进行 50 ns 的 MD 模拟，应用周期性边界条件，在 NPT 系综中进行模拟，保持温度 323 K 和压力 1 bar，使用 Verlet 算法积分运动方程，时间步长 2 fs。
   • Pu22:C-1311 复合物的约束 MD 模拟：对 Pu22:C-1311 系统进行 1000 ns 的约束分子动力学模拟，应用对应配体和 DNA 质子间 NOE 接触的距离约束，使用 GROMACS 实现的约束势，对所有约束距离使用相同的力常数 239 kcal mol^?1·nm^?2。采用 Daura 方法对轨迹进行聚类分析，RMSD 截止值设为 0.25 nm，提取主导构象簇（占模拟时间的 67.5%）的中心结构作为 Pu22:C-1311 非共价加合物的最具代表性结构。
   • UAs 复合的 Pu22 的伞形采样（US）：采用哈密顿 REUS 方法获得 DNA:UA 相互作用的自由能剖面图，定义反应坐标 ξ 为 Pu22 的 3′和 5′ G - 四链体质心与双吖啶配体咪唑并吖啶酮环系统质心之间的距离，引入并保持 G - 四链体中两个 K⁺离子与鸟嘌呤残基 O6 原子的距离约束以确保 Pu22 G - 四链体结构稳定。
   
   

为避免 US 模拟起始构型的偏差，先将两个配体分子放置在 Pu22 的 3′和 5′ G - 四链体平面附近，结合 Pu22:C-1311 复合物的 NOESY 数据应用距离约束模拟 G4: 配体复合物的形成，去除 NMR-based 距离约束后，对所得复合物进行 100 ns 模拟，通过施加谐波势将反应坐标从 0.4 nm 增加到 3.0 nm，力常数为 597.5 kcal mol^?1·nm²。从这些轨迹中以 0.1-nm 间隔选择 US 计算的初始结构，每个窗口平衡 50 ns，然后模拟 1000 ns，每个系统总模拟时间为 27 μs，采用 REUS 方法以 1000 ps 的窗口交换率增加构象采样，使用加权直方图方法（WHAM）获得自由能剖面图。

数据可用性

论文及补充信息包含评估结论所需的所有数据，原始 NMR 光谱和 MD 轨迹可在科学审查和材料转移协议完成后由<