靶向间皮素的感染性选择性溶瘤腺病毒用于系统治疗的研究意义

这篇研究聚焦于溶瘤腺病毒（OAds）。研究发现，间皮素（MSLN）靶向的 OAd（AdML - VTIN）能降低肝脏摄取，提高肿瘤积累，在肺癌和胰腺癌模型中展现显著抗肿瘤效果，还可逃避中和抗体，改变血凝特性，为晚期癌症系统治疗带来新希望。

　　### 引言
癌症治疗一直是医学领域的难题，许多癌症患者确诊时已处于晚期。肺癌是癌症死亡的主要原因之一，转移性肺癌患者 5 年生存率仅 7% ；胰腺癌也极具侵袭性，预计到 2030 年将成为癌症死亡的第二大原因，且多数患者确诊时已错过手术时机。因此，晚期癌症急需更有效的全身治疗方法。

基因治疗和病毒治疗策略为癌症治疗带来了新希望，溶瘤腺病毒（OAds）是其中备受关注的一种。OAds 可通过在肿瘤内扩增和强烈的细胞杀伤作用发挥抗肿瘤效果，但全身给药面临诸多挑战，如在肿瘤细胞中的转导效率低、被非靶器官（如肝脏）截留以及被中和抗体（nAbs）灭活等。为解决这些问题，研究人员开发了多种策略，其中针对肿瘤特异性抗原的靶向治疗备受关注。

间皮素（MSLN）是一种在多种恶性肿瘤（如肺癌、胰腺癌、卵巢癌和间皮瘤）中高表达，而在正常组织中低表达或不表达的细胞表面糖蛋白，成为肿瘤治疗的理想靶点。此前研究已开发出 MSLN 靶向的 OAd（AdML - VTIN），本研究旨在进一步评估其用于肺癌和胰腺癌全身治疗的潜力。

结果

1. MSLN 靶向 OAds 的分布：研究人员通过基于结合的筛选系统，利用高多样性的腺病毒纤维文库，成功筛选出 MSLN 靶向的感染性选择性 OAd——AdML - VTIN。AdML - VTIN 具有野生型 E1 基因、E3 区域的单个 loxP 位点，且其纤维 knob 的 AB 环中，MSLN 靶向基序（VTINRSA）取代了主要的柯萨奇病毒和腺病毒受体（CAR）结合域。

实验表明，AdML - VTIN 对表达 MSLN 的胰腺癌细胞在体外和体内均具有选择性结合和细胞毒性。在裸鼠尾静脉注射实验中，与携带野生型 Ad5 纤维的 AdML - 5WT 相比，AdML - VTIN 在肝脏的分布显著降低，在肿瘤中的病毒拷贝数在 48 小时和 7 天时明显更高，这表明 AdML - VTIN 改变了肝脏嗜性并在肿瘤中复制。
2. 病毒在原代小鼠肝细胞中的分布：进一步研究发现，AdML - VTIN 在肝脏实质细胞中的分布显著低于 AdML - 5WT，而在非实质细胞中的分布与 AdML - 5WT 相似。这表明重新设计的纤维使 AdML - VTIN 能够逃避肝脏实质细胞的截留。
3. AdML - VTIN 全身给药和瘤内直接注射的抗肿瘤效果：在 MSLN⁺肿瘤（A549）的皮下异种移植模型中，比较 AdML - VTIN 静脉注射（i.v.）和瘤内注射（i.t.）的抗肿瘤效果。结果显示，两种给药方式均能显著降低肿瘤体积并抑制肿瘤生长，且效果无明显差异。在病毒复制和瘤内扩散方面，虽然静脉注射早期肿瘤中的病毒量低于瘤内注射，但在第 8 天时，静脉注射组的病毒拷贝数达到了与瘤内注射组相同的水平。
4. AdML - VTIN 与非靶向 AdML - 5WT 全身注射在 MSLN⁺肿瘤模型中的抗肿瘤效果比较：在 A549 皮下异种移植模型中，AdML - VTIN 静脉注射后，肿瘤从第 5 天开始缩小，在第 8 - 19 天肿瘤体积最小，且在第 26 天，其肿瘤体积显著低于 AdML - 5WT 治疗组。同时，AdML - VTIN 在肿瘤中的病毒复制和瘤内扩散能力明显强于 AdML - 5WT，这进一步证实了 MSLN 靶向 OAd 通过全身给药的选择性和有效性。
5. 多次给药 MSLN 靶向 OAd 抑制肿瘤再生：在部分接受 AdML - VTIN 治疗的肿瘤中，4/10 的肿瘤完全消失，其余肿瘤虽出现暂时生长抑制后又复发。对复发肿瘤进行多次 AdML - VTIN 静脉注射后，4/6 的肿瘤生长得到显著抑制，表明 AdML - VTIN 在低剂量下也具有促进全身治疗的能力。
6. 全身注射 AdML - VTIN 在胰腺癌模型中的抗肿瘤效果：在人胰腺癌细胞系 AsPC1 的研究中，AdML - VTIN 在体外对 AsPC1 细胞具有细胞毒性，在体内对 AsPC1 异种移植瘤的生长抑制作用明显强于 AdML - 5WT。在肿瘤中的病毒复制实验中，AdML - VTIN 在第 5 天和第 10 天的病毒复制量分别比 AdML - 5WT 高 23 倍和 12 倍，表明 MSLN 重靶向的 OAd 在胰腺癌异种移植模型的全身治疗中具有增强的治疗效果。
7. AdML - VTIN 在胰腺癌 PDX 小鼠模型中的治疗效果：利用患者来源的异种移植（PDX）模型评估 AdML - VTIN 的治疗效果。PDX 肿瘤中 MSLN 表达水平高，但 Ad 受体 CAR 表达水平低。实验结果显示，AdML - VTIN 静脉注射后，与未治疗组相比，具有显著的抗肿瘤效果，且肿瘤体积明显小于 AdML - 5WT 治疗组，表明 MSLN 靶向 OAd 可用于人类胰腺癌的全身治疗。
8. Ad 纤维修饰对中和作用和血凝活性的影响：在中和实验中，纤维修饰的 Ad5 载体 AdML - VTIN 比未修饰的 Ad 更能抵抗人血清中的中和免疫反应。同时，AdML - VTIN 的血凝活性发生改变，基于 AB 环修饰的 Ad5 与野生型 Ad5 相比，血凝作用显著降低，这表明基于 AB 环修饰的嗜性改变是避免血凝的有效方法。

讨论

OAds 虽在多种癌症治疗中展现出潜力，但全身应用时面临效率和选择性的挑战，如肝脏截留、nAbs 和肿瘤基质等障碍。肝脏截留导致大量病毒被肝脏摄取，不仅降低了到达肿瘤的病毒量，还可能引发肝脏毒性。此外，许多癌症细胞中 Ad 主要受体 CAR 的表达较低，限制了野生型 Ad 的靶向性。

本研究中，MSLN 靶向的 OAd（AdML - VTIN）表现出独特的优势。它能够逃避肝脏截留，在肿瘤中实现更好的积累。尽管静脉注射初期，AdML - VTIN 在 MSLN⁺肿瘤中的病毒量低于瘤内注射，但在第 8 天，静脉注射组的病毒拷贝数与瘤内注射组相当，表明系统给药的 AdML - VTIN 能在肿瘤中特异性积累，并通过病毒复制和扩散发挥抗肿瘤作用。

对于 AdML - VTIN 低肝脏分布的机制，研究发现其纤维 knob 的 AB 环中 CAR 结合位点被肿瘤特异性基序取代后，减少了对 CAR 表达肝细胞的分布。这一结果与其他研究中关于 CAR 结合消融对 Ad 载体生物分布影响的结论一致。

在应对 nAbs 方面，纤维修饰的 AdML - VTIN 在 nAb 实验中表现出更强的抗性，这表明带有 AB 环靶向基序的 OAds 能够一定程度地逃避预先存在的抗体，更有利于全身治疗。此外，AdML - VTIN 的血凝活性改变，基于 AB 环修饰的嗜性改变有效避免了血凝，这对于全身应用的治疗药物来说至关重要。

在胰腺癌 PDX 模型中，AdML - VTIN 也表现出强大的抗肿瘤活性。胰腺癌的肿瘤微环境（TME）复杂，富含癌相关成纤维细胞、细胞外基质和具有免疫抑制特征的免疫细胞，这些构成了药物递送的屏障。但 AdML - VTIN 能够克服这一屏障，有效作用于肿瘤细胞，展现出良好的治疗效果。

综上所述，系统注射 MSLN 靶向的 OAds 与非靶向 OAds 相比，肝脏截留显著降低，肿瘤积累更好，全身给药时具有显著的抗肿瘤效果。Ad 纤维的 AB 环修饰改变了血凝活性，使其对人血清中预先存在的 nAbs 更具抗性。这些结果表明，MSLN 靶向的 OAd 是一种极具前景的晚期癌症全身治疗药物。

材料和方法

1. 细胞和培养：使用经过鉴定的人肺腺癌 A549 细胞系和人胰腺癌细胞系 AsPC1，均购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。细胞培养在 ATCC 推荐的条件下，使用含有特定成分的培养基，并添加 10% 胎牛血清，在 37°C、5% CO₂的湿润环境中培养。
2. Ad 设计：AdML - VTIN 具有野生型 E1 基因、E3 区域的单个 loxP 位点，VTINRSA 基序取代纤维 knob 的 AB 环中 CAR 结合域；AdML - 5WT 作为对照，含有野生型 E1 基因、E3 区域的单个 loxP 位点和 Ad5 的野生型纤维。通过多种方法测定病毒滴度。
3. 肝细胞分离：通过胶原酶消化和 Percoll 密度梯度离心分离肝脏实质细胞和非实质细胞（包括库普弗细胞），具体方法参照相关文献。
4. 腺病毒拷贝数的定量分析：用 DNase I 处理病毒溶液去除非衣壳化病毒 DNA，然后纯化 DNA，使用 E4 引物通过 SYBRGreen qPCR 分析总病毒拷贝数。
5. FACS 分析：用于分析肝脏细胞分离情况以及 AsPC1 细胞中 MSLN 的表达，通过对细胞进行染色和流式细胞仪检测实现。
6. IHC 检测肿瘤中 MSLN 的表达：对福尔马林固定石蜡包埋的肿瘤组织进行免疫组织化学染色，使用抗 MSLN 单克隆抗体，通过特定试剂盒显色检测 MSLN 表达。
7. 体内载体分布：在裸鼠皮下接种 A549 细胞，待肿瘤达到一定大小后，注射病毒，在不同时间点处死小鼠，纯化肿瘤组织 DNA，通过 qPCR 定量分析腺病毒 DNA 拷贝数。
8. 体内已建立肿瘤的治疗效果：在裸鼠皮下接种 A549 或 AsPC1 细胞建立肿瘤模型，待肿瘤达到一定大小后，进行 AdML - VTIN 或 AdML - 5WT 的静脉注射或瘤内注射治疗。同时建立胰腺癌 PDX 模型，对肿瘤进行相应处理后评估治疗效果，包括监测小鼠状态、测量肿瘤直径计算体积，以及在不同时间点处死小鼠分析肿瘤中的病毒拷贝数和腺病毒六邻体蛋白表达。
9. 多次注射试验：当肿瘤体积达到一定标准时，对复发肿瘤进行多次 AdML - VTIN 静脉注射，监测小鼠状态和肿瘤直径。
10. 中和试验：在 96 孔板中进行，将人血清与病毒混合孵育后感染 A549 细胞，7 天后观察细胞病变效应（CPE），计算 CPE 阳性率。
11. 血凝试验：从人血中提取红细胞，将病毒稀释液与红细胞悬液混合，在 96 孔板中孵育后，通过肉眼观察血凝情况。
12. 统计分析：使用 GraphPad Prism（版本 10）进行统计分析，两组比较采用两尾无配对 Student's t 检验，多组比较采用 ANOVA 和多重比较检验，结果以均值 ± 标准差或均值 ± 标准误表示，p < 0.05 认为具有统计学意义。

数据可用性

支持本研究结果的数据可在合理请求时从相应作者处获得。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）和美国国家科学基金会（National Science Foundation）的资助，同时感谢相关人员对论文的评论和协助。

作者贡献

研究设计由 M.S.-D.、Y.M. 和 M.Y. 完成；实验操作由 M.S.-D. 和 M.Y. 进行；数据获取由 M.S.-D.、Y.M.、K.J. 和 B.R. 负责；数据分析由 M.S.-D. 和 Y.M. 开展；试剂提供由 M.S.-D. 和 P.H. 完成；论文撰写由 M.S.-D. 负责，所有作者参与了论文的审核和编辑。

利益声明

Y.M. 和 M.Y. 是腺病毒文库系统相关专利的发明人；M.S - D.、P.H. 和 M.Y. 是腺病毒构建体及使用方法相关专利的发明人。