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为解决 mNGS 结果解读难题，研究人员以结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）、肺炎支原体（Mycoplasma pneumoniae）和耶氏肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii）为代表，开展回顾性分析研究。结果显示 mNGS 检测不同病原体有较高准确率，但其低读数结果解读存在挑战，该研究为临床应用提供重要参考。
在医学检验领域，精准检测病原体一直是临床诊断和治疗的关键环节。近年来，宏基因组下一代测序（mNGS）技术崭露头角，它能在无需预先假设的情况下，同时检测样本中所有病原体的核酸，为感染性疾病的诊断带来了新的希望。然而，mNGS 结果的解读却成为一大难题。一方面，临床医生面对 mNGS 阳性结果时，需要综合患者的病史、影像学检查以及当前抗生素治疗情况等多方面信息，才能判断检测到的病原体与疾病是否相关；另一方面，从实验室角度看，虽然可以通过多种方法对 mNGS 阳性结果进行验证，但逐一验证工作量巨大，在实际临床中难以实现。而且，样本中人类基因比例的差异、核酸提取效率的不确定性以及测序深度的变化，都使得 mNGS 检测的读长计数不稳定，这也给判断 mNGS 结果是真阳性还是假阳性带来了困难。
为了解决这些问题，华中科技大学同济医学院附属同济医院的研究人员开展了一项多中心回顾性研究。研究人员收集了 2021 年 10 月 12 日至 2023 年 10 月 11 日期间，同济医院汉口、光谷和中法新城院区通过 mNGS 检测出的结核分枝杆菌、肺炎支原体和耶氏肺孢子菌的所有连续病例数据。通过实验室检测和对结果的综合临床解读，评估 mNGS 结果的准确性，并比较真阳性和假阳性结果在读长计数和相对丰度上的差异。该研究成果发表在《BMC Microbiology》杂志上。
在研究中，研究人员用到了以下几个主要关键技术方法：
- mNGS 检测：针对不同样本类型，如血液、呼吸道样本、脑脊液、脓液、组织等，采用不同处理方法，提取核酸后进行文库构建和测序，测序后通过生物信息学分析筛选出病原体序列。
- 实验室验证技术：针对不同病原体采用不同验证方法，如结核分枝杆菌通过培养和 GeneXpert MTB/RIF 检测；肺炎支原体通过靶向聚合酶链反应（PCR）和 IgM 抗体检测；耶氏肺孢子菌通过自行研发的靶向 PCR 技术检测。
- 统计分析方法：运用描述性统计分析人口数据，采用 Mann–Whitney U 检验分析相关数据，以判断差异是否具有统计学意义。
研究结果如下：
- 患者人口统计学特征：研究期间共确定了 69 例结核分枝杆菌、57 例耶氏肺孢子菌和 83 例肺炎支原体病例。结核分枝杆菌病例中男性 43 例、女性 26 例，平均年龄 49 岁；肺炎支原体病例中男性 40 例、女性 43 例，平均年龄 16 岁；耶氏肺孢子菌病例中男性 36 例、女性 21 例，平均年龄 44 岁。检测这些病原体的主要样本类型是支气管肺泡灌洗液（BALF）。
- mNGS 结果的临床和实验室验证：从临床角度看，mNGS 检测结核分枝杆菌、肺炎支原体和耶氏肺孢子菌的准确率分别为 87.0%（60/69）、97.6%（81/83）和 78.9%（45/57）；从实验室角度看，相应的准确率分别为 92.7%（51/55）、82.3%（51/62）和 83.9%（26/31）。几乎所有样本类型都存在真阳性和假阳性病例。
- 真阳性和假阳性组读长计数和相对丰度的比较：对临床判定为假阳性和真阳性的 mNGS 结果进行比较，发现结核分枝杆菌、耶氏肺孢子菌和肺炎支原体在读长计数和相对丰度上的差异均无统计学意义（P≥0.05）。
研究结论和讨论部分指出，mNGS 技术是传统病原体检测方法的有效辅助手段，但在解读其结果时，需要综合考虑实验室检测参数和临床信息。不同病原体的 mNGS 检测结果在实验室验证和临床综合评估中的一致性存在差异。对于结核分枝杆菌和耶氏肺孢子菌，实验室验证的一致性较高；而肺炎支原体则相反，可能与检测样本不同有关。虽然 mNGS 在检测某些病原体方面具有优势，如检测结核分枝杆菌比传统培养方法表现更优，检测肺炎支原体比传统方法敏感性更高，检测耶氏肺孢子菌敏感性可达 100%，但它也存在局限性，如检测时间长、成本高、低读长计数时难以区分真阳性和假阳性等。此外，读长计数作为辅助诊断工具的价值还需进一步探索。该研究为临床合理应用 mNGS 技术提供了重要依据，有助于提高感染性疾病的诊断准确性，推动精准医学的发展。同时，研究人员也指出了研究存在的局限性，如回顾性研究设计、mNGS 技术本身的局限性以及研究对象仅涉及三种病原体等，为后续研究指明了方向。
