突破物种限制，MERFISH率先用于细菌单细胞原位空间转录组学研究

群体水平的细菌动力学通常来自单细胞的异质行为，细菌单细胞RNA测序可提供数千个细胞的转录组表达谱，然而，空间信息在细胞解离和RNA提取过程中丢失了，空间组织往往是细菌动力学跨越长度尺度范围的重要调节器。基于图像的单细胞转录组学方法通过直接成像和识别固定细胞内天然空间环境中的RNA，提供了这种空间背景，然而该方法受到细菌mRNA的高密度的阻碍。

为解决这个问题，Vizgen联合创始人Moffitt及其研究团队开发了细菌-MERFISH方法，借鉴膨胀显微技术将细胞膨胀至50倍或1000倍，在一系列环境中对单个细胞中的数千个操纵子进行分析，绘制了数十万个细胞中大部分转录组的表达图，从而深入了解细菌单细胞异质性、转录组的细胞内组织结构以及细菌对肠道中微米级生态位的适应性。研究成果于1月24日发表在Science杂志。

 研究结果 

细菌-MERFISH准确描述了大肠杆菌中数千个操纵子

MERFISH 技术采用组合光学条形码，结合单分子FISH能够识别成千上万种不同的 mRNA 分子。然而，要解码这些条形码，来自不同分子的荧光信号必须是光学可分辨的。对于传统的高分辨率光学显微镜来说，每立方微米只能分辨出少量分子，真核细胞的转录组可满足此限制进行目标检测。相比之下，一个对数生长期的大肠杆菌细胞约含有8000个 mRNA 分子，细胞体积约为3 μm³，使得 mRNA 的总密度几乎比可用衍射极限成像分辨的密度高出三个数量级（图1A），因此限制了对细菌 mRNA 的成像，成为转录组规模成像的一个重大挑战。

为克服细菌 mRNA 的密度问题，研究人员利用膨胀显微技术开发了一种针对细菌 FISH 优化的膨胀工具箱，能够实现高达1000倍的体积膨胀（图1B）。简而言之，将大肠杆菌培养到中期，用多聚甲醛（PFA）固定，消化细胞壁，在10倍稳健膨胀（TREx）凝胶中膨胀，然后将样品重新包埋在不膨胀的稳定凝胶中。该次膨胀使大肠杆菌宽度增加3.7±0.8倍，由于这种线性膨胀与~50倍的体积膨胀一致，将这种方法称为50X膨胀方案。在用97个操纵子库染色的膨胀细胞中，可以看到单个荧光点，并用MERFISH对这些分子进行鉴定（图1，C-H），表明膨胀足够解决该目标文库的mRNA密度问题。

利用1057 个操纵子的 MERFISH 探针组对 50X 膨胀的大肠杆菌进染色仍能分辨出单个颗粒， 但RNA 信号重叠的频率有所增加。为了应对这种重叠，研究人员开发了一种迭代膨胀实验方案，用50X膨胀和稳定的细胞在第二种TREx凝胶中膨胀，然后包埋在第二种稳定凝胶中。该方案使细胞宽度扩大11.1±2.2倍，由于这种线性膨胀与~1400倍的体积膨胀一致，将这种方法称为1000X膨胀方案。当用该方案膨胀细胞时，染色1057个操纵子可以清楚地区分来自单个RNA的信号及其身份（图1，I-K）。

图1. 利用细菌-MERFISH对大肠杆菌中数千个操纵子的图像表达谱分析

为了对细菌-MERFISH的性能进行基准测试，在对数期大肠杆菌中结合50X或1000X膨胀，对99、1057或1930个操纵子进行了两次重复测量，分割细胞，并对RNA进行分类（图1，M-O）。测量结果与Bulk RNA-seq之间存在强相关性，表明细菌-MERFISH可以准确地描述RNA表达，丰度跨越四个数量级。细菌-MERFISH的检测效率（图1P）优于scRNA-seq的报道值。同样，每个细胞检测到的分子总数（图1R）可以与测序方法检测到的分子总数相媲美。

因此，细菌- MERFISH是一种高性能和通用的基于图像的细菌单细胞转录组学方法，它以其低假阳性率和大动态范围、检测效率和通量补充了scRNA-seq方法。

细菌-MERFISH揭示了碳源切换下的异步分层响应

细菌单细胞转录组学的一个有前景的方面是能够识别异质细菌行为，并通过计算重新同步单个细胞对环境刺激的不同步反应，揭示被群体平均掩盖的动态。研究人员利用细菌-MERFISH重新审视了经典的双相生长现象，在葡萄糖和木糖的混合物中培养大肠杆菌。正如预期，细菌培养在葡萄糖耗尽之前呈对数生长，在碳源切换时暂停生长，然后在木糖上恢复对数生长，最终在两种糖都耗尽后进入稳定期（图2A）。研究人员在这个过程中收集了大肠杆菌细胞，以50X膨胀分析了1057个操纵子的表达（图2，A-C）。

图2. 细菌-MERFISH揭示了对碳饥饿的随机分层反应

在相似生长阶段收获的细胞在很大程度上是共整合的，即使是微小的转录差异，如在葡萄糖或木糖对数期生长中收集的细胞之间的转录差异，也得到了分析（图2E)。这一分析揭示了单细胞水平上丰富的行为多样性。细胞被分成两大组，对应于生长或非生长条件下的细胞（图2E），并被细分为14个不同的簇（图2F)。这些簇具有独特的基因表达谱（图2，G和H）和不同条件下的丰度（图2I）。在碳源切换期间，研究人员观察到细胞的异质性表达（图2，E-I）。只有一小部分簇表达了与木糖利用相关的操纵子，而大多数簇表达了与培养基中未包含的碳源利用相关的操纵子。另外，作者还注意到特定碳源探索存在明显的时间顺序（图2L）。细胞逐步探索多种碳源利用操纵子，最终表达与木糖利用相关的基因。

总之，所需途径的稳态水平可以通过整个调控中短暂的、连贯的表达爆发来维持，并且当面临碳饥饿时，大肠杆菌采用响应性多样化策略，其中葡萄糖的缺乏会触发碳利用操纵子的随机分层进程。细菌- MERFISH具有表征亚群和计算同步细胞进行动态反应的能力，在解剖编码这种细胞异质性的多种调节机制方面具有重要作用。

细菌-MERFISH揭示了mRNA细胞内定位模式的多样性

为了探索大肠杆菌转录组的空间组织，利用了在肉汤培养基（LB）中生长的 50 X膨胀的 1057 个操纵子的测量数据。为确定细胞内RNA定位，将每个mRNA分子映射到每个细胞的轴向和径向位置，并将这些坐标归一化为细胞长度和宽度(图3A)。然后计算每个mRNA在所有测量细胞中的平均轴向和径向分布(图3，B-D)。研究人员鉴定了在细胞质（例如dnaKJ）、膜（例如ptsG）和极区（例如dnaB）富集的mRNA（图3，C和D），并注意到这些主要模式的多样性变化，mRNA在膜的不同位置、在多个细胞质位置或在单个中心焦点上富集（图3E）。为避免样本膨胀引入的失真，作者利用未膨胀的 smFISH 对少量操纵子进行验证，观察到了高度相似的定位模式（图3F）。

图3. 大肠杆菌转录组具有由蛋白质组和基因组组织形成的多种模式

为了进一步对这种空间多样性进行分类，利用模式相似性度量来可视化和聚类空间模式。该分析产生了五个主要的 mRNA 分布簇（图3G），这些簇内部显示出一定程度的连续空间变化。为探究可能的模式形成机制，作者研究了簇与 mRNA 特征之间的相关性。转录本长度、GC 含量、丰度和半衰期与空间分布的相关性较弱，而编码蛋白位置的相关性较强（图3，H- J）。同时，mRNA转录的基因组位点也与空间模式密切相关。

总之，测量结果统一了先前提出的细菌转录组组织的两种模型——基因组或蛋白质组特征决定了组织。具体来说，这两种特征都在mRNA的全局组织中发挥作用，蛋白质位置决定细胞质与膜的富集，基因组特征决定细胞质和膜上的轴向富集。当然，也发现了多个偏离这些全局规则的空间模式的mRNA，暗示mRNA特异性定位机制仍有待发现，且可能具有功能意义。

细菌- MERFISH提供了一种测量这种模式的直接方法，这将极大地促进细菌转录组细胞内组织的机制和功能研究。

细菌-MERFISH揭示了肠道共生菌对结肠中不同生态位的适应性

研究人员利用人类肠道共生菌B. theta单定植的无菌小鼠（图4A）探索细菌-MERFISH在复杂的空间结构环境中分析基因表达的能力。B. theta可能会根据局部多糖的可用性调节其多糖的利用，因此设计了一个涵盖多糖利用位点（PUL）内的多种转运蛋白、通常与PUL表达调控相关的混合双组分系统（HTCS）以及少量与中央代谢和其他细菌功能相关的基因panel，总共针对 159 个操纵子（图 4B ）。

图4. 哺乳动物结肠中肠道共生菌对微米级生态位的适应。

从单菌定植的小鼠体内切除结肠，并将样品进行石蜡包埋和切片（图 4A）。采用 50 X膨胀方案对切片进行膨胀，并用MERFISH染色。16S rRNA 信号显示，B. theta的分布基本得以保留（图4C和D）。通过MERFISH可以在单个细胞中识别出单个mRNA（图4E和F），且许多操纵子的表达在空间上存在差异。有些mRNA在整个腔内均有表达（例如BT_0364 和BT_4671），而其他一些则在黏液层附近表达更为显著（例如BT_3958和BT_2894）（图 4G）。对空间变化进行量化发现，黏液距离是基因表达的一个协变量（图4，H-K）。将空间区域分为粘液相关或管腔相关区室，发现这两个区室之间有38个操纵子存在显著差异（图4L），相对于靠近黏液层的B. theta，管腔B. theta可能上调中枢代谢元件，而黏液相关的生态位支持获得更大的多糖多样性。

总之，细菌会精细调节基因表达以适应肠道内的微米级生态位。借助细菌-MERFISH技术能够对各种复杂环境中的这种微米级适应情况进行详细分析。

参考文献：https://doi.org/10.1126/science.adr0932 

细菌-MERFISH是一种基于图像的单细胞转录组学方法，通过将优化的膨胀显微工具箱与MERFISH相结合，克服了细菌细胞内大量mRNA的密度的挑战。可以成像大量的细胞，将基因表达与细胞形态或细胞内分子组织联系起来，在原位描述细菌的行为。无论是单一物种生物膜内特殊细胞状态之间的相互作用，还是混合群落中不同物种之间的相互作用，细菌- MERFISH都提供了一种将空间临近性、细胞微环境和整体结构与基因表达联系起来的方法。

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