单细胞测序如何改变科学探索的未来？

有了单细胞测序方法，科学家们能够确定细胞类型特异性的基因表达和多组学读数，并解析细胞异质性，而批量细胞RNA-seq分析时观察到的表达模式正是由这种异质性驱动的。欢迎阅读下文，了解单细胞RNA测序和单细胞多组学的价值、这些方法推动的高影响力科学研究，以及开展单细胞测序实验所涉及到的步骤。

01 推动高影响力的科学研究

若要了解单细胞RNA测序（scRNA-seq）的影响，有时候需要站在科学家的角度，利用它来解答健康和疾病领域的一些重大问题。想象一下，您是一位神经科学家，希望了解在神经发育疾病中失调的健康细胞过程。或者，您是一位免疫学家，在寻找定义炎症性疾病的基因表达特征和生物标志物。也许，您是一位癌症研究人员，正试图揭开让治疗受挫的瘤内异质性。

为了获得这些答案，需要创新的实验和技术能力来不断突破极限——因为科学发现都是在技术前沿获得的。

其他领域的科学家也经历了同样的状况。意大利天文学家伽利略·伽利雷（Galileo Galilei）用一台配备两张镜片的望远镜观测到月球上的环形山。之后望远镜经过重新设计，配备更高质量的镜片和更长的镜筒，这使他的视野放大了八倍。在进一步改进后，他的视野放大了三十倍，能够清晰观测到木星及其三颗轨道卫星(1)。

02 单细胞RNA测序能为您的研究带来哪些独特的好处？

生物学如同浩瀚的宇宙。它非常复杂，其中有许多独特的单体（细胞）在相互作用，扮演着不同的角色，构建和驱动更大体系中的各种过程。就像伽利略探索宇宙一样，发现和定义这些细胞也需要高分辨率工具，它们能够揭开促成生物复杂性的基因表达异质性。

何时需要单细胞分辨率？

RNA测序（RNA-seq）或芯片分析等批量细胞转录组方法是一类功能强大的工具，帮助科学家揭开这种异质性，提供混合样本的基因表达平均视图。随后，技术创新上的飞跃在单细胞方法上达到顶峰，科学家们可利用这种方法来定义细胞类型特异性的基因表达，并解析细胞异质性，而平均读数所显示的表达模式正是由这种异质性驱动的（图1）。这使得研究人员有能力更全面地表征组织异质性，鉴定稀有细胞类型，并逐个细胞地解析分子机制。有了对生物系统的更真实了解，研究人员就能自信地规划下一步的实验，并获得更深入的可行动见解。

图1. 从批量细胞到单细胞基因表达，分辨率在不断提高。左图显示了某个样本的转录景观整体视图，包含6个基因的平均表达水平。右图代表单细胞基因表达数据，揭示了样本真正的细胞异质性，以及从平均视图中观察到的表达模式的细胞来源。

例如，英国Wellcome Sanger研究所的研究人员利用单细胞和批量细胞RNA测序技术来绘制哺乳动物先天性免疫反应的进化图(2)。不同细胞之间的先天性免疫反应表现出很高的可变性。批量细胞RNA-seq分析研究了各个物种之间与反应相关的转录差异，而单细胞RNA-seq则观察了细胞之间的差异。作者研究了一段时间内的单细胞基因表达（包括比批量分析更早和更晚的反应阶段），以了解反应的动态和程度。

转录分析鉴定出数百个基因，它们在不同哺乳动物的病原体反应中存在差异。差异大的基因（包括细胞因子）具有独特的启动子结构，其中含有密集的转录因子结合基序。而参与免疫调节的基因（如转录因子和激酶）对免疫应激的反应则相对保守。

单细胞分析表明，与差异小的基因相比，差异大的基因表现出更高的细胞间表达可变性。这些发现为了解不断调整病原体反应的进化机制提供了线索。

RNA读数如何最大限度增加单细胞分析的见解？

包括流式细胞术在内的其他技术可以对细胞进行分选，并通过一组特定蛋白质的单细胞读数来深入了解细胞身份。然而，仅凭精选蛋白质的表达模式可能不足以捕获细胞异质性或动态细胞状态的全貌，就像了解一个人的身体特征（如身高、头发颜色、眼睛颜色），也只能从有限的角度来判断他是谁。

例如，免疫学家向来使用细胞表面蛋白对免疫细胞亚群进行分类。不过，当细胞从一种分化成另一种时，基因会受到快速动态的调控，让细胞进入下一个稳定的细胞状态。当细胞类型从一种转变为另一种时，细胞表面标志物不一定发生显著变化，因此这些瞬时状态可能无法检测。

然而，scRNA-seq让研究人员能分析样本中活跃分化细胞的单细胞转录本水平，为他们提供解析瞬时细胞状态所需的分辨率。

举个例子，在一项国际多中心三期临床试验中，研究人员曾结合使用scRNA-seq和流式细胞术，从患者样本中鉴定出瞬时的造血干/祖细胞群（HSPC），它们推动了自体干细胞成功移植。这项临床试验旨在测试新的联合疗法是否能提高多发性骨髓瘤患者的HSPC动员效果(3)。

03 单细胞多组学技术如何让您的研究受益？

对于复杂样本中的多个细胞类型，从描述性分析到功能性理解，需要对细胞生物学进行多组学角度的分析。通过单细胞多组学（不同组学数据集的分析和整合），科学家们可测定同一来源样本的多个细胞特征。这些特征包括全转录组基因表达、细胞表面蛋白表达、免疫组库序列（包括T细胞和B细胞受体（TCR/BCR）），以及用于观察表观基因组调控的开放染色质区域。在单次实验带来信息更丰富的数据后，研究人员还拥有更多优势，比如保留珍贵样本、提高生产力、减少批次效应带来的误差，以及节省其他高价值资源（从科研经费到人员时间）。

单细胞多组学技术带来的突破

单细胞多组学方法不仅能改进实验过程，还能帮助科学家们在健康和疾病研究的最关键领域取得新进展。那些凭转录本平均视图或单一参数读数无法获得的发现正在改变我们对癌症、传染病、神经退行性疾病等疾病的认识和治疗。

例如，单细胞免疫分析为免疫学问题提供了一种多组学解决方案，可以检测整个转录组、细胞表面蛋白以及全长配对的T细胞或B细胞受体序列。

英国弗朗西斯·克里克研究所领导的研究团队利用单细胞免疫分析研究了肾透明细胞癌（ccRCC，最常见的肾癌形式）的肿瘤微环境，并揭示了这种免疫原性肿瘤的治疗反应和耐药的驱动机制(4)。

对于ccRCC等瘤内异质性较高的免疫原性肿瘤，研究人员往往难以探究其免疫景观。批量细胞RNA-seq提供的信息并不全面，甚至仅凭scRNA-seq也不足以描绘关键的免疫细胞群。通过同时分析同一个细胞的TCR序列和基因表达谱，研究人员可测定克隆扩增并鉴定肿瘤微环境中经常被忽视的免疫细胞。

最终，他们确定了应答者与无应答者之间的关键差异。研究人员发现，对药物纳武利尤单抗（nivolumab）有应答的患者样本中含有与纳武利尤单抗结合并表达PD-1的瘤内CD8+ T细胞扩增群，而无应答者的样本中则没有。

从鉴定全新的细胞类型和状态，到揭示疾病、治疗应答和耐药的潜在机制，单细胞测序正在推动突破性研究，并有望改变生物学和医学。无论是无法解释的疾病，还是人体或自然界中尚未探索的系统，过去模糊不清的东西正逐渐变得清晰起来。在我们迈向科学的未来时，手头的工具就像伽利略的望远镜一样在不断聚焦和放大，并带来了新的深度见解，许多见解在十年前是无法想象的。

04 开展单细胞测序实验需要哪些步骤？

就像学习任何新技术一样，单细胞测序流程中也可能有您目前不大熟悉的元素。尽管您的实验流程已经习惯了使用流式细胞术、RNA-seq和qPCR等方法，但新方法可能将您的研究提升至新水平，这足以抵消学习曲线。

单细胞测序与这些方法（包括新一代测序和数据分析的开展）之间的差异不容忽视，但它们之间也有许多相似之处，可以让您信心满满地步入单细胞测序的世界。过去的培训和实验，就像肌肉记忆一样，提高了您的技术知识、动手能力和直觉。这些能力与实践相结合，将让您在新方法上取得成功。

又一个实验而已：从样本制备开始

每个生物学实验，包括单细胞技术，都可以分解成几个关键步骤：制备样本、运行分析和查看结果。

图2. 每个单细胞实验的三个基本步骤。

单细胞测序实验的第一步是样本制备，作为流式细胞术用户您可能已经很熟悉这个步骤——通过酶解或机械解离、细胞分选或其他细胞分离技术，从整个样本中生成有活力的单细胞悬液。随后是细胞计数和质控步骤，以确保您的样本中包含适当浓度的活细胞，且不含细胞团块和死细胞碎片。如果需要，您还可以用抗体对样本进行染色，标记细胞表面蛋白及其他生物分析物，或对感兴趣的细胞类型进行FACS富集。

解离样本的步骤将根据起始材料和实验目的的不同而变化。可能还需要额外的制备步骤，具体取决于组织质量、样本丰度、细胞大小，或是否需要提取细胞核进行染色质可及性分析。无论具体的考虑因素如何，生成高质量单细胞悬液这一基本原则适用于各种样本类型。

图3. 图中描绘了细胞技术（如流式细胞术）与10x Genomics的单细胞测序技术之间的异同点。

分析基因表达的三种方式：全都关于cDNA

单细胞RNA-seq、RNA-seq和逆转录qPCR（RT-qPCR）的共同之处是分离RNA并将其转化为cDNA进行分析。不过，每种方法在具体过程和最终读数上有所不同。RNA-seq和RT-qPCR都是从大量细胞中分离RNA，然后将其转化为cDNA。RNA-seq是利用cDNA来构建新一代测序文库，进而测定整个转录组的基因表达。

RT-qPCR则是从cDNA中扩增出特定靶点，并通过荧光测定其表达水平(5)。RT-qPCR仅限于已知的靶点，而RNA-seq则能提供无偏的全转录组基因表达。不过，这两种方法都只能提供整个细胞群的基因表达平均读数。单细胞RNA-seq则是在分离RNA之前先将单个细胞分离到微孔或单个微反应容器中。然后用细胞特异性的条形码对RNA进行标记，确保每个细胞的cDNA都能追溯到原始细胞。与RNA-seq类似，利用标记后的cDNA来构建新一代测序文库，以测定每个细胞的全转录组基因表达。

图4. 单细胞基因表达分析的工作原理：从样本到测序文库。

图5. 图中描绘了RT-qPCR技术与10x Genomics的单细胞测序技术之间的异同点。

一个共同的目标：了解转录组

无论是从大量样本的RNA开始进行RNA-seq或RT-qPCR，还是从单细胞的RNA开始进行单细胞RNA-seq，每种技术最终都要回到相同的终点数据：基因表达水平。

对于这些分析来说，有一种共同的数据分析方法，那就是分析不同实验或样本状况（如正常vs.病变）之间的基因表达差异。例如，对对照样本和发炎皮肤组织的转录图谱进行比较，可以揭示那些定义炎症状态的转录特征以及在疾病背景下失调的基因活性。有了单细胞分辨率，您能够将这些转录见解提升到新的水平，并确定是否有特定的细胞亚群负责引起炎症反应。

利用您通过RNA-seq和RT-qPCR实验定量基因表达时获得的已知基因表达标志物，以及熟悉的差异基因表达分析模式（与RNA-seq和RT-qPCR数据的分析类似），您可以非常直观地跳转到单细胞基因表达分析。此外，10x Genomics的软件提供了易用的数据分析和可视化工具，可以帮助您顺利过渡到单细胞数据。

图6. 图中描绘了批量细胞RNA-seq与10x Genomics的单细胞测序技术之间的异同点。

05 单细胞多组学助您提升洞察力

基于测序的读数之所以强大，是因为它能够从同一个单细胞中获取多个生物分析物。如果说单细胞基因表达以一种颜色提供了高度详细的信息，那么单细胞多组学则以全光谱提供了同样详细的信息，让您对样本有最真实的了解。

坚持不懈的创新让10x Genomics的Chromium单细胞平台能够提供同一个细胞的多组学读数，反映细胞复杂性。与传统方法相比，单细胞多组学简化了您在获得相同结果时需要开展的实验和需要分析的样本。这不仅节约了宝贵的样本，还确保了更高的生物学准确性，因为您不需要对不同样本的数据集进行匹配，也不需要通过计算来推断各组学类型之间的关系。

单细胞测序实验的最终结果非常值得您花时间去了解并努力掌握。实验完成，数据到手，探索才刚刚开始。

通过我们近期举办的单细胞入门大讲堂录播视频，您将了解到更多单细胞实验设计和数据分析方面的信息。

1. 如何设计您的第一个单细胞实验？

2. 单细胞数据分析全流程：数据质控和可视化（需扫描下方二维码观看）

参考资料：

1. Library of Congress, Digital Collections. Finding Our Place in the Cosmos: From Galileo to Sagan and Beyond. Galileo and the Telescope. https://www.loc.gov/collections/finding-ourplace-in-the-cosmos-with-carl-sagan/articles-and-essays/modeling-the-cosmos/galileo-and-the-telescope

2. Hagai T, et al. Gene expression variability across cells and species shapes innate immunity. Nature 563: 197–202 (2018). doi: 10.1038/s41586-018-0657-2

3. Crees ZD, et al. Motixafortide and G-CSF to mobilize hematopoietic stem cells for autologous transplantation in multiple myeloma: a randomized phase 3 trial. Nat Med 29: 869–879 (2023). doi: 10.1038/s41591-023-02273-z

4. Au L, et al. Determinants of anti-PD-1 response and resistance in clear cell renal cell carcinoma. Cancer Cell 39: 1497–1518 (2021).

5. Wagner E. Monitoring gene expression: quantitative real-time rt-PCR. Methods Mol Biol 1027: 19–45 (2013).