蛋白质共变网络揭示新型铁死亡诱导剂AX-53802的作用机制及协同治疗靶点

编辑推荐：针对铁死亡诱导剂作用机制解析的难题，日本东京工业大学团队通过蛋白质定位与共变网络分析（PLOM-CON）技术，发现GPX4是AX-53802的直接靶点，揭示其通过膜转位和TfR1/F-actin聚集体形成调控铁代谢的防御机制，并鉴定出FAK/Src等协同靶点，为癌症联合治疗提供新策略。

　　在细胞死亡研究领域，铁死亡（ferroptosis）作为一种铁依赖性的新型细胞死亡方式，近年来成为癌症治疗的热门靶点。然而现有铁死亡诱导剂（FINs）存在选择性差、体内抗肿瘤效果不足等问题，且其作用机制（MoA）的系统性解析仍面临挑战。传统方法如基因表达谱分析难以捕捉蛋白质层面的动态变化，而单纯靶点鉴定又会忽略关键的间接效应分子。针对这些瓶颈，东京工业大学Fumi Kano团队创新性地采用蛋白质定位与共变网络分析（PLOM-CON）技术，对新型铁死亡诱导剂AX-53802展开深入研究。

研究团队首先通过>50,000种化合物的筛选鉴定出AX-53802，其诱导的细胞死亡可被铁死亡抑制剂Fer1特异性阻断。时间序列显微成像显示，该化合物能在1小时内引发脂质过氧化，并导致特征性的细胞肿胀破裂。为解析其分子机制，研究人员设计了三组对照实验（未处理组、AX-53802处理组、AX-53802+Fer1组），在9个时间点（5-60分钟）采集了35种铁死亡相关蛋白的免疫荧光图像，量化其丰度、修饰水平和亚细胞定位特征。通过图形套索算法构建的共变网络显示，GPX4在药物处理组中表现出最显著的连接性变化。

深入分析发现，AX-53802通过丙炔酰胺基团与GPX4第46位硒代半胱氨酸形成共价键（IC₅₀=0.34μM），引发独特的膜转位现象——这一早期事件（5-10分钟）不受Fer1挽救，证实其发生于脂质过氧化上游。随后GPX4与转移铁蛋白受体1（TfR1）、F-actin形成核周聚集体，导致铁摄取障碍（FerroOrange检测显示游离铁减少）。这种铁代谢重编程被证明是细胞对抗铁死亡的防御机制。

研究创新性地采用两种网络挖掘策略发现协同靶点：基于相关性异常评分锁定pFAK和F-actin；通过网络扩展从BioGrid数据库筛选出MDM2、ezrin等靶点。功能验证显示，FAK/Src抑制剂（PF-228/PP2）可通过抑制STAT3-Nrf2抗氧化通路增强AX-53802的细胞杀伤效果，而ezrin抑制剂NSC668394则通过调控膜张力在下游发挥保护作用。这种"双刃剑"式靶点发现为癌症联合治疗（如GPX4+FAK/Src共抑制）和神经保护策略（如MDM2抑制）提供了新思路。

关键技术包括：（1）PLOM-CON网络分析结合时间分辨显微成像；（2）基于图形套索算法的部分相关矩阵计算；（3）网络扩展整合BioGrid蛋白互作数据；（4）GPX4酶活检测和GFP标记动态追踪；（5）铁代谢相关探针（FerroOrange、BODIPY-C11）的应用。

研究结果部分：

1. AX-53802通过独特机制诱导铁死亡：区别于erastin等经典诱导剂，该化合物不引发同步化细胞死亡，但能快速（1小时）触发脂质过氧化，且该过程可被铁螯合剂和抗氧化剂阻断。
2. PLOM-CON网络揭示GPX4的核心地位：网络拓扑分析显示GPX4连接度变化最显著，其膜转位和聚集体形成分别对应药物作用的早期和晚期事件。
3. TfR1-F-actin聚集体形成防御屏障：共聚焦成像和脉冲追踪实验证实，聚集体导致转铁蛋白循环延迟，通过降低游离铁水平抵抗铁死亡。
4. 协同靶点的发现与验证：FAK/Src抑制剂在SW480等癌细胞中显著增强AX-53802效果，而DPPH实验排除了抗氧化作用的干扰。

这项研究的重要意义在于：（1）建立了蛋白质动态网络解析药物MoA的新范式；（2）揭示了铁死亡防御的膜转位-聚集体形成新机制；（3）提供了GPX4靶向治疗的优化策略（如联合FAK/Src抑制）；（4）拓展了PLOM-CON技术在靶点发现中的应用边界。未来研究可进一步探索GPX4膜转位的结构基础，并在动物模型中验证联合治疗的可行性。该成果为铁死亡相关疾病的精准干预提供了理论框架和技术支撑。