感染相关条件下沙门氏菌伴侣蛋白与共伴侣蛋白的差异表达机制及意义

本文聚焦于沙门氏菌（Salmonella）。研究发现，在细胞质 Mg2+饥饿这一感染相关条件下，沙门氏菌的伴侣蛋白（如 DnaK）和共伴侣蛋白（如 DnaJ 等）会出现差异表达。该机制受 PhoP 调控，这一发现对理解细菌应对感染应激的策略意义重大。

　　

引言

蛋白质的正确折叠对细胞功能至关重要，分子伴侣在其中发挥着关键作用。细菌拥有三种主要的伴侣系统：核糖体相关的触发因子（TF），它在蛋白质从核糖体合成过程中进行共翻译折叠；DnaK/DnaJ/GrpE 系统，主要在翻译后发挥作用，帮助蛋白质折叠和防止聚集；以及 GroEL/GroES 系统，仅在翻译后起作用 。

大肠杆菌（Escherichia coli）在热激时，会通过依赖替代 σ 因子 RpoH 的启动子，增加dnaKdnaJ和groESgroEL操纵子的转录，但不改变 TF 编码基因tig的转录。细菌会在转录起始、翻译、稳定性和活性等多个层面控制 RpoH 的丰度。

沙门氏菌（Salmonella enterica serovar Typhimurium）在感染过程中会面临细胞质 Mg²⁺饥饿的压力，这会危及蛋白质稳态。因为 Mg²⁺饥饿会降低 ATP 浓度，影响蛋白质的溶解性、合成以及依赖 ATP 的蛋白酶的蛋白水解作用。同时，Mg²⁺饥饿会激活 PhoP，它是 Mg²⁺稳态和毒力的主要调节因子，还会改变 TF 和 DnaK 与核糖体的结合情况，DnaK 能在不依赖 J 结构域共伴侣蛋白的情况下，减少蛋白质合成并帮助细菌抵御高渗应激和细胞质 Mg²⁺饥饿。鉴于此，研究人员探究在细胞质 Mg²⁺饥饿条件下，相关伴侣蛋白和共伴侣蛋白基因是否会差异表达。

结果

1. 细胞质 Mg²⁺饥饿以 PhoP 依赖的方式增加dnaK mRNA 水平，但不影响dnaJ的表达：dnaK和dnaJ基因被认为属于同一个操纵子，但它们在细胞质 Mg²⁺饥饿时可能会差异表达。研究发现，在低 Mg²⁺（10 μM）环境中生长 5 小时的野生型鼠伤寒沙门氏菌，其dnaK mRNA 水平比在高 Mg²⁺（10 mM）环境中生长的细菌高三倍，这是由于细胞质 Mg²⁺浓度低导致的，而非细胞外 Mg²⁺浓度低。PhoP 对dnaK mRNA 水平的升高起关键作用，phoP缺失突变体在低 Mg²⁺环境中生长 5 小时后，dnaK mRNA 水平比野生型菌株低三倍。而dnaJ mRNA 水平在低 Mg²⁺和高 Mg²⁺环境中相似，且phoP突变体在低 Mg²⁺环境中dnaJ mRNA 水平比野生型更高，这表明dnaK和dnaJ基因在面对细胞质 Mg²⁺限制时会差异表达。
2. 细胞质 Mg²⁺饥饿不促进 J 结构域共伴侣蛋白基因的表达：鼠伤寒沙门氏菌有三种 J 结构域共伴侣蛋白（CbpA、DjlA 和 DnaJ）。研究发现，细胞质 Mg²⁺饥饿时，cbpA mRNA 水平在低 Mg²⁺和高 Mg²⁺环境中相似，而djlA mRNA 水平在低 Mg²⁺环境中比高 Mg²⁺环境中低四倍多，且在phoP突变体中比野生型菌株更高，这说明细胞质 Mg²⁺饥饿会以 PhoP 依赖的方式降低djlA的表达，与dnaK的表达变化相反。
3. 细胞质 Mg²⁺饥饿增加 DnaK 与 DnaJ 的蛋白质比例：在细胞质 Mg²⁺饥饿条件下，DnaK 与 DnaJ 的蛋白质比例比 Mg²⁺充足条件下高两倍，这与相应基因的 mRNA 水平变化相符。在phoP突变体中，该比例比野生型菌株低，进一步表明细胞质 Mg²⁺饥饿会增加 DnaK 与 DnaJ 的比例，且这一过程依赖 PhoP。
4. 细胞质 Mg²⁺饥饿以 PhoP 依赖的方式降低tig的表达：野生型鼠伤寒沙门氏菌在细胞质 Mg²⁺饥饿时，tig mRNA 水平比 Mg²⁺充足条件下低八倍。phoP突变体在低 Mg²⁺环境中生长 5 小时后，tig mRNA 水平比野生型菌株高三倍，TF 蛋白水平高两倍。不过，野生型菌株在高 Mg²⁺和低 Mg²⁺环境中生长时，TF 蛋白水平相似，这表明在细胞质 Mg²⁺饥饿时，TF 蛋白的稳定可能抵消了tig mRNA 水平的下降。
5. PhoP 在细胞质 Mg²⁺饥饿时使dnaJ mRNA 不稳定：研究人员检测了dnaK和dnaJ编码区域以及二者之间 85 nt 的基因间区域的 mRNA 丰度。在细胞质 Mg²⁺饥饿的细菌中，dnaK编码区域的 mRNA 丰度比基因间区域和dnaJ编码区域高约 2.5 倍，而在高 Mg²⁺环境中，这三个区域的 mRNA 丰度相似。进一步研究发现，PhoP 不影响dnaK mRNA 的稳定性，但会使dnaJ mRNA 的半衰期在野生型菌株中比phoP突变体低 2.5 倍，这表明 PhoP 增加dnaK转录的同时，降低了dnaJ mRNA 的稳定性。
6. PhoP 通过稳定 RpoH 蛋白增加dnaK mRNA 丰度：在dnaK启动子区域未发现 PhoP 结合位点，但鉴定出两个与大肠杆菌dnaK启动子区域高度保守的 RpoH 结合位点。研究人员发现 PhoP 并非通过激活rpoH转录来增加 RpoH 丰度，而是可能通过降低 ATP 浓度，间接稳定 RpoH 蛋白。实验表明，表达 AtpAGD 的质粒可以纠正phoP突变体中异常高的 ATP 水平，增加 RpoH 蛋白和dnaK mRNA 的水平，说明 PhoP 通过稳定 RpoH 增加dnaK mRNA 丰度，且可能还存在其他机制。
7. DnaK 的 C 末端截短会增加 RpoH 的量和活性，而去除三个 J 结构域共伴侣蛋白则不会：在大肠杆菌中，DnaK/DnaJ/GrpE 系统可控制 RpoH 的量和活性。研究人员在鼠伤寒沙门氏菌中探究 DnaK 是否能在不依赖 J 结构域共伴侣蛋白的情况下对 RpoH 进行负反馈调节。结果发现，缺失 C 末端 74 个氨基酸的dnaK14突变体中，RpoH 的量比野生型菌株和cbpA djlA dnaJ三突变体高 50 倍，且 RpoH 激活的groEL基因的 mRNA 水平也更高。而三突变体中 RpoH 的量比野生型菌株略低，这表明 DnaK 的 C 末端结构域可在不依赖 J 结构域共伴侣蛋白的情况下降低 RpoH 丰度，且 J 结构域共伴侣蛋白可能会阻碍 DnaK 降低 RpoH 的量和活性。
8. ** dnaK和dnaJ基因并非总是共线性的 **：参与同一生化或生理途径的基因常相邻，即共线性，有助于基因在水平转移时的生存。dnaK和dnaJ基因在许多物种中属于同一操纵子，但在细胞质 Mg²⁺饥饿时会差异表达，且 DnaK 可独立于 DnaJ 发挥作用。研究发现，在拟杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）、嗜热菌（Thermotoga maritima）和沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）等细菌的基因组中，dnaK和dnaJ基因并非共线性。

讨论

分子伴侣在蛋白质稳态中发挥多种作用，对共伴侣蛋白的需求各异。在细胞质 Mg²⁺饥饿这一干扰蛋白质稳态的应激条件下，DnaK 及其 J 结构域共伴侣蛋白受到相反的调控。PhoP 作为 Mg²⁺稳态的主要调节因子，促进dnaK转录的同时使dnaJ mRNA 不稳定。PhoP 还通过稳定 RpoH 进一步促进dnaK转录，且 DnaK 可在不依赖 J 结构域共伴侣蛋白的情况下，通过其 C 末端结构域降低 RpoH 的量和活性。

细胞在面临影响蛋白质稳态的应激时，通常会上调蛋白质维持和修复途径。J 结构域共伴侣蛋白可将需要伴侣作用的蛋白质底物传递给 DnaK 并刺激 ATP 水解。但鼠伤寒沙门氏菌在细胞质 Mg²⁺饥饿时，似乎会限制 DnaK/J 结构域共伴侣蛋白 / GrpE 系统的经典伴侣作用，因为它会以 PhoP 依赖的方式抑制三个 J 结构域共伴侣蛋白编码基因中的两个。

经典的操纵子基因共调控由启动子驱动，使两个或多个基因共表达，如groES和groEL基因。但dnaK和dnaJ所在的操纵子在不同物种间存在差异，它们的基因间区域长度不同，可能存在不同的调控机制。在细胞质 Mg²⁺饥饿时，dnaKdnaJ操纵子可能转录为单一信息后再切割成稳定性不同的 mRNA，也可能在基因间区域终止转录，或者受小非编码 RNA（sRNA）调节。

在营养充足时，dnaK和dnaJ基因的共调控有助于维持其编码蛋白质的化学计量平衡，利于 DnaK/DnaJ/GrpE 伴侣系统的经典活性。而在细胞质 Mg²⁺饥饿时，二者的差异表达使 DnaK 与 DnaJ 的比例升高，增加的游离 DnaK 可能与其他细胞结构相互作用，发挥如结合核糖体和抑制翻译等功能，促进细菌在低细胞质 Mg²⁺环境中的生存。

RpoH 可激活dnaKdnaJ和groESgroEL启动子的转录。细胞质 Mg²⁺饥饿通过降低 ATP 浓度，以 PhoP 依赖的方式促进dnaK转录，使 RpoH 积累，这与热应激时 RpoH 的积累机制不同。此外，DnaK 通过其 C 末端 74 个氨基酸对 RpoH 的量和活性进行负反馈调节，且这种调节在细胞质 Mg²⁺饥饿和 Mg²⁺充足条件下均存在，且不依赖 J 结构域共伴侣蛋白。

综上所述，干扰蛋白质稳态的特定应激决定了 DnaK 及其共伴侣蛋白的差异或协同表达与活性。

材料和方法

1. 细菌菌株和生长条件：本研究使用的鼠伤寒沙门氏菌菌株源自野生型菌株 14028s。菌株在 N - minimal 培养基（pH 7.7）中培养，添加 0.1% 酪蛋白氨基酸、38 mM 甘油和不同浓度的 MgCl₂ ，在 37°C、250 rpm 振荡的水浴中培养。过夜培养物在高 Mg²⁺（10 mM）培养基中培养，洗涤后稀释到不同 Mg²⁺浓度的培养基中。携带 AtpAGD 表达质粒的菌株，在洗涤后稀释到低 Mg²⁺（10 μM）培养基中，并添加 50 μg/mL 氨苄青霉素维持质粒，生长 2.5 小时后用 1 mM 异丙基 -β - D - 1 - 硫代半乳糖苷（IPTG）诱导 AtpAGD 表达。
2. RNA 提取和定量实时 PCR：细菌培养物按上述条件培养，在特定时间收集 0.5 mL 培养物与 1 mL RNAprotect Bacteria Reagent 混合稳定 RNA，离心收集细胞。细胞沉淀用含 2 mg/mL 溶菌酶的 Tris - EDTA（TE）重悬裂解，用 RNeasy Kit 提取总 RNA，取 1 μg RNA 合成 cDNA，稀释后用于 qRT-PCR，通过标准曲线确定各基因 mRNA 的相对含量。
3. 体内 RNA 稳定性测定：细菌在 10 mL N - minimal 培养基中培养 5 小时后，收集预加利福平的样品，然后加入利福平（终浓度 200 μg/mL）终止 RNA 合成，在不同时间点收集样品。按上述方法提取 RNA 并进行 qRT-PCR，计算剩余 mRNA 的比例。
4. 蛋白质免疫印迹（Western blot）：细菌培养物在特定时间测量 OD₆₀₀，收集等量细胞离心，沉淀用含 100 μg/mL 溶菌酶的 B - PER Bacterial Protein Extraction Reagent 重悬裂解，加入 2×Laemmli 样品缓冲液煮沸。裂解物经电泳、转膜后，用特定抗体进行检测，使用不同的荧光或化学发光方法检测目标蛋白。
5. 细菌细胞内 ATP 测量：细菌按上述条件培养特定时间后，使用 BacTiter - Glo Microbial Cell Viability Assay Kit 测量 ATP 水平，并根据培养物的 OD₆₀₀进行归一化处理。