编辑推荐：
本文通过自适应实验室进化（ALE）技术筛选出白色链霉菌（Streptomyces albulus）低 pH 耐受突变株 ALE3.6，其在 pH 3.7 时 ε- 聚赖氨酸（ε-PL）产量提升 37.9%。借助全基因组重测序和 qRT-PCR 确定关键基因，逆向工程验证其功能，为工业生产提供理论依据。
### 引言
白色链霉菌作为生产 ε- 聚赖氨酸（ε-PL）的细胞工厂备受关注。ε-PL 是一种由 25 - 35 个 L - 赖氨酸单体通过 α-COOH 和 ε-NH
2缩合反应聚合而成的天然抗菌肽，在食品、医药、畜牧等领域应用广泛。然而，白色链霉菌生产 ε-PL 时，发酵 pH 会从约 6.8 降至 3.0 左右，其最佳生长 pH 为 6.0，而 ε-PL 生产的最佳 pH 约为 4.0。长期处于低 pH 环境会损害细胞完整性，降低 ε-PL 的生物合成效率。
此前虽有动态 pH 调节策略提高了 ε-PL 产量，但工业化应用时 pH 控制繁琐。同时，对白色链霉菌低 pH 耐受机制的研究有限。本研究旨在通过逐步降低环境 pH，利用自适应实验室进化（ALE）技术提高白色链霉菌的低 pH 耐受性，探究其耐受机制，为工业生产提供理论支持。
结果
- 自适应实验室进化：对白色链霉菌 GS114 进行 ALE，在 2232 小时（93 天）内连续传代 62 次，使其适应从 pH 4.0 降至 3.6 的环境。在不同 pH 阶段分离突变株并比较 ε-PL 合成能力，筛选出 ALE4.0、ALE3.8 和 ALE3.6。摇瓶发酵显示，ALE3.6 最终干细胞重量（DCW）虽比亲本菌株 GS114 降低 16.7%，但 ε-PL 产量增加 17.9%，单位生物量的 ε-PL 合成量显著提高 37.7%。
- ALE3.6 在分批补料发酵中的表现：斑点试验表明，ALE3.6 在 pH 4.0 和 3.7 的固体培养基上孢子生长情况优于 GS114。不同恒定 pH 条件下的分批补料发酵结果显示，在 pH 3.7 时，ALE3.6 的最终 DCW 和 ε-PL 产量显著高于其他条件。优化 pH 条件下，ALE3.6 的最终 ε-PL 产量相比 GS114 提高了 37.9%，单位生物量的 ε-PL 合成量提高了 15.3%。
- 自适应进化对 ALE3.6 细胞膜稳定性的影响：通过气相色谱 - 质谱（GC-MS）分析细胞膜脂肪酸含量，发现 ALE3.6 在 pH 6.8 和 3.0 时，多种脂肪酸含量与 GS114 存在差异，饱和脂肪酸与不饱和脂肪酸的比例增加，细胞膜脂肪酸平均链长也有所增加。用二苯基己三烯（DPH）测量细胞膜各向异性，发现 pH 3.0 处理后，ALE3.6 的膜流动性比 GS114 提高 238.3%。此外，ALE3.6 在 pH 3.0 处理后的细胞内 pH（pHi）为 6.28 ± 0.11，显著高于 GS114 的 5.81 ± 0.06。透射电子显微镜（TEM）观察显示，低 pH 处理后，ALE3.6 细胞结构完整，而 GS114 细胞壁相对粗糙，有大量无细胞内结构的丝状死细胞。
- ALE3.6 的重测序分析：对 ALE3.6 进行全基因组重测序，与亲本菌株 GS114 参考基因组比对，发现 22 个单核苷酸多态性（SNPs）、955 个插入和缺失（InDels）以及 1034 个拷贝数变异（CNVs）。分析 CNVs 发现 10 个可能与低 pH 耐受相关的基因，qRT-PCR 显示低 pH 条件下，desA、gatD 和 mamU 在 ALE3.6 中的表达水平显著高于 GS114。
- 关键突变对白色链霉菌低 pH 发酵适应性的影响：将携带 desA、gatD 和 mamU 基因的 pIB139 质粒导入 GS114，构建过表达菌株 OE-desA、OE-gatD 和 OE-mamU；同时用携带目标基因反义片段的重组质粒构建基因表达减弱菌株 anti-desA、anti-gatD 和 anti-mamU。qRT-PCR 验证了基因表达变化。斑点试验显示，过表达突变株在 pH 3.7 时生长性能显著优于 GS114，反义 RNA 菌株生长明显减弱。60 小时分批补料发酵结果表明，OE-desA 的最终 DCW 比 GS114 显著增加 104.0%，OE-desA、OE-gatD 和 OE-mamU 的最终 ε-PL 产量分别比 GS114 增加 169.0%、53.8% 和 69.3%；anti-desA 和 anti-gatD 的最终 DCW 相比 GS114 有所降低，而 anti-desA、anti-gatD 和 anti-mamU 的最终 ε-PL 产量与 GS114 无显著差异。
- 关键突变对维持白色链霉菌稳定性的作用：o - 硝基苯 - β - D - 半乳糖吡喃糖苷试验表明，过表达菌株在低 pH 条件下能更长时间维持细胞膜完整性。分析过表达菌株细胞膜脂肪酸含量发现，在 pH 3.0 时，OE-desA、OE-gatD 和 OE-mamU 的脂肪酸组成发生变化，不饱和脂肪酸含量增加。用荧光探针测量 pHi，发现 pH 3.0 时，过表达菌株的 pHi 显著高于 GS114。用 DPH 荧光探针评估膜流动性，发现 pH 3.0 处理后，OE-desA 和 OE-gatD 的膜流动性显著增加，OE-mamU 无明显变化。TEM 分析显示，低 pH 条件下，过表达菌株细胞形态完整，无细胞壁损伤和细胞质泄漏。
讨论
本研究通过 ALE 获得低 pH 耐受突变株 ALE3.6，其在低 pH 环境下生长和 ε-PL 合成能力显著提升。全基因组重测序和 qRT-PCR 分析确定了 desA、gatD 和 mamU 为关键基因，逆向工程进一步验证了它们在提高低 pH 耐受性和 ε-PL 产量方面的重要作用。
与以往研究相比，本研究逐渐降低 pH 进行 ALE 发酵，筛选出的 ALE3.6 能在 pH 3.6 快速生长并在 pH 3.7 高效生产 ε-PL。虽然在分析 SNP 突变位点时存在挑战，但不能排除其对细菌低 pH 耐受机制的间接影响。desA 在不同菌株中的作用存在差异，在 GS114 中对低 pH 耐受性和 ε-PL 产量的提升作用更显著。
白色链霉菌通过改变细胞膜脂肪酸组成、增强细胞壁和细胞膜前体合成来维持低 pH 环境下的生存。过表达 desA 增加了细胞膜不饱和脂肪酸含量，提高了膜流动性但未损害低 pH 耐受性；gatD 为细胞壁修复提供氨并维持细胞内 pH；mamU 在维持细胞膜磷脂平衡、调节基因表达和控制膜生物合成途径方面发挥关键作用。未来研究将聚焦于全面探索低 pH 耐受的全局调控因子以及结合转录组学详细分析白色链霉菌在低 pH 胁迫下的动态调控机制。
材料与方法
- 菌株和培养条件：以白色链霉菌 GS114 为初始菌株，详细介绍了实验中使用的菌株和质粒。大肠杆菌在 LB 培养基中培养，白色链霉菌的孢子在 BTN 培养基中培养，种子培养在 M3G 培养基中进行，发酵使用 YP 培养基。在不同实验中，根据需求调整培养基的 pH 和成分。
- 自适应实验室进化：将白色链霉菌 GS114 的孢子在种子培养基中培养 24 小时，然后以 8% 的接种比例接入初始 pH 为 4.0 的 M3G 培养基中，30°C、200rpm 培养 36 小时后转接至新鲜培养基。当细胞生长稳定后，每次将 pH 降低 0.2，选择在 pH 4.0 的 M3G 固体平板上生长快速且产孢高的菌落作为低 pH 耐受性增强的进化菌株。
- 培养和发酵：详细描述了白色链霉菌孢子的培养、种子培养以及在 1L 和 5L 生物反应器中的发酵过程。包括低 pH 处理、分批补料发酵的条件控制，如 pH、溶解氧、葡萄糖浓度的调控等。
- 全基因组重测序：培养 ALE3.6 菌株，离心收集菌体，洗涤后液氮速冻，送公司进行全基因组重测序。介绍了 DNA 文库构建、测序平台以及数据分析方法，包括 SNP、InDel 和 CNV 的分析。
- 重组菌株构建：设计引物通过 PCR 扩增目标基因片段，将其插入质粒 pIB139 构建过表达质粒；同时构建反义 RNA 质粒用于基因沉默。通过大肠杆菌 ET12567/pUZ8002 介导的属间接合将质粒转入白色链霉菌 GS114。
- ε-PL 产量和 DCW 的测定：发酵液离心后，用甲基橙法测定上清液中的 ε-PL 产量，洗涤沉淀并干燥至恒重测定干细胞重量。
- 斑点试验：刮取不同菌株的孢子制成悬浮液，调整 OD600后进行系列稀释，点种在不同 pH 的 M3G 平板上，观察菌落生长情况。
- qRT-PCR 分析：酸处理后的发酵液速冻，提取总 RNA 并合成 cDNA，以其为模板进行 qRT-PCR，用 2?△△Ct法分析基因相对表达量，以管家基因 hrdB 为内参。
- 细胞膜完整性和流动性分析：通过 o - 硝基苯 - β - D - 半乳糖吡喃糖苷（ONPG）试验检测细胞膜完整性，用 DPH 测量细胞膜各向异性来分析膜流动性。
- 脂肪酸提取和分析：离心收获菌丝体，洗涤后进行皂化和甲基化处理，用 GC-MS 分析甲基酯混合物，确定细胞膜脂肪酸种类。
- 细胞内 pH 测量：采用改进的方法，对发酵液离心洗涤后处理，用 BCECF-AM 荧光探针测量细胞内 pH。
- 电子显微镜分析：低 pH 处理的菌丝体洗涤固定后，由专业公司进行染色、包埋和切片，用透射电子显微镜观察细胞横截面。
- 统计分析：所有实验重复三次，数据以平均值 ± 标准差表示，使用 SPSS 22.0 进行统计分析，采用单因素方差分析和 Tukey 事后检验，P 值表示显著性水平。
