接种物生长对小麦籽粒中沙门氏菌和产志贺毒素大肠杆菌（STEC）抗性的影响及意义探究

本文聚焦小麦面粉引发的食源性疾病问题，研究不同接种物生长方法对沙门氏菌和产志贺毒素大肠杆菌（STEC）在小麦籽粒上干燥存活、长期储存及调质处理后反应的影响，为食品安全干预措施评估和实验设计提供关键依据，助力保障面粉安全。

　　### 研究背景
近年来，与小麦面粉相关的食源性疾病爆发事件增多，引发了人们对理解面粉及其原料小麦籽粒中病原体抗性的关注。小麦籽粒属于低水分食品（LMF），水活度（a_w）在 0.45 - 0.55 之间，不利于细菌生长。主要的食源性病原体包括沙门氏菌和产志贺毒素大肠杆菌（STEC），其中沙门氏菌在低水分食品召回和爆发事件中更为普遍，而 STEC 与面粉相关的爆发事件联系更为紧密。已有研究表明，这些病原体能在小麦籽粒和面粉中存活较长时间。

实验设计中的接种物制备方法可能导致不同的实验结果和解释。由于目前对病原体在自然环境中如何污染低水分食品的了解有限，评估多种预生长条件有助于更好地掌握病原体污染后的存活模式。同时，明确能增强病原体对相关压力抗性的接种物生长方法，对于评估食品安全干预措施的有效性至关重要。

调质是面粉加工中的重要步骤，在调质过程中使用具有消毒作用的溶液，对制粉行业来说是一种经济有效的减少面粉潜在污染的方法，且相较于热处理，更不易影响面粉质量。然而，接种物生长方法对细菌在低水分食品表面干燥后对化学处理耐受性的影响尚未得到充分研究。

实验设计

1. 实验材料：选用商业混合的硬红春小麦籽粒，由 Mennel Milling Company 提供。实验使用了多种细菌菌株，包括用于干燥存活研究的 3 种沙门氏菌（Salmonella Enteritidis PT30、Typhimurium、Mbandaka）和 3 种 STEC（O157:NM、O26:H11、O121:H19），以及用于调质实验的另外 2 种沙门氏菌（Tennessee、Montevideo）和 2 种 STEC（O157:H7）。所有菌株均对 80 μg/mL 利福平具有抗性。
2. 接种物生长方法：采用 5 种接种物生长方法，分别为肉汤接种（Broth）、有氧平板接种（lawn-aerobic）、厌氧平板接种（lawn-anaerobic）、有氧平板酸适应接种（acid-adapted）和有氧平板低密度接种（low inoculum）。接种后对小麦籽粒进行水活度平衡和储存，观察不同条件下病原体的存活情况。
3. 调质处理：准备了 4 种调质溶液，分别为水（作为对照）、800 ppm 氯化水、5% 乳酸（LA） + 26.6% 氯化钠（NaCl）和 5% 亚硫酸氢钠（SBS）。对接种后的小麦籽粒进行不同时间的储存，然后用调质溶液处理，检测病原体数量的变化。
4. 检测与分析：通过细菌计数、pH 测试、生物膜形成测试等方法，对实验样本进行检测。利用对数线性模型和 Weibull-Mafart 模型对病原体存活数据进行建模分析，通过统计分析判断不同因素对病原体存活和灭活效果的影响。

实验结果与分析

1. 病原体在小麦籽粒上初始适应低 a_w过程中的浓度变化：除低接种量的接种物外，其他接种条件下的初始接种水平相似。在接种到小麦籽粒的过程中，肉汤培养和酸适应培养的病原体细菌密度变化更大。在水活度平衡过程中，肉汤和酸适应接种的病原体在籽粒上的减少幅度也更为显著。水活度平衡后，不同接种物生长方法的病原体在籽粒上的水平存在显著差异。
2. 长期储存过程中小麦籽粒上病原体存活的建模分析：储存过程中小麦籽粒的 a_w保持稳定。多数情况下，对数线性模型和 Weibull-Mafart 模型的相关参数相似，但对于肉汤培养接种和鼠伤寒沙门氏菌（S. Typhimurium），Weibull-Mafart 模型能更好地描述其存活曲线的拖尾效应。总体而言，模型的选择取决于接种物生长方法和菌株。
3. 肉汤接种物与其他琼脂培养接种物的干燥耐受性比较：肉汤培养接种的病原体在低水分环境中适应时间更长，其存活模式与其他琼脂培养方法不同，这可能与细菌细胞的生理状态差异有关。例如，琼脂表面生长的固定化细胞（sessile cells）能形成生物膜，相比肉汤中的浮游细胞（planktonic cells），在适应干燥条件方面更具优势。
4. 菌株和接种物生长方法对病原体在小麦籽粒上长期存活的影响：不同菌株和接种物生长方法影响病原体在小麦籽粒上的长期存活。肠炎沙门氏菌（S. Enteritidis PT30）在琼脂培养接种时，D 值较高，可能与其产生卷曲（curli）促进生物膜形成有关。酸适应接种的病原体，STEC 的 D 值显著升高，而沙门氏菌的 D 值无明显变化。低接种量的病原体 D 值较低，且初始细胞水平对某些菌株的持续存活有影响。
5. 小麦调质过程中病原体灭活效果的实验设计因素分析：影响调质处理灭活效果的因素包括病原体种类、接种物生长方法和接种后调质前的适应时间。不同调质处理对病原体减少的效果不同，5% LA + 26.6% NaCl 组合的灭活效果最佳。接种物生长方法也影响调质处理的效果，例如厌氧平板接种的细菌在调质处理中的减少幅度高于有氧平板接种的细菌，但在水控制组中差异不显著。
6. 不同调质处理效果的比较：标准调质过程（仅用水）对病原体数量的减少效果不明显。与之前的研究相比，本研究中各种调质处理的效果相似，但存在一定差异，这可能与菌株选择、实验设计因素（如小麦类型、初始水分含量）等有关。总体而言，5% LA + 26.6% NaCl 处理的病原体减少幅度最大，其次是 5% SBS，然后是 800 ppm 氯化水。
7. 其他影响调质过程中细菌灭活效果的参数：较长的适应时间可能使病原体在某些处理条件下更具生存能力，尤其是肉汤和厌氧平板接种的病原体。实验中发现第一天样品的 a_w受天气条件影响较大，为控制实验设计，建议进行 a_w平衡和适当的干燥或适应时间。
8. 细菌菌株间的存活差异：不同细菌菌株的存活情况存在差异。例如，S. Enteritidis PT30 具有独特的形态和较高的生物膜形成能力，其在储存过程中的 D 值明显高于其他沙门氏菌菌株。鼠伤寒沙门氏菌也有独特的存活特征，如在非肉汤接种时也出现拖尾效应。本研究使用的利福平抗性菌株可能存在基因组变化，影响应激反应，需要进一步的表型评估。

研究结论

接种物生长方法对沙门氏菌和 STEC 在小麦籽粒上的干燥耐受性和后续存活有显著影响。不同接种物生长方法和细菌菌株在病原体初始适应和长期干燥储存过程中的存活模式不同，这可能与生物膜形成能力有关。有氧平板接种的实验结果更具一致性，较高的接种量能为病原体在干燥和化学处理过程中提供保护。酸适应能显著增强 STEC 对干燥和化学压力的耐受性。

本研究评估了多种调质处理的病原体灭活效果，发现初始适应可能使病原体对处理更具抗性。研究强调了标准化实验设计的重要性，特别是在病原体培养方面，这有助于提高挑战研究在面粉安全干预措施讨论中的适用性。未来可利用基因组工具进一步探究接种物培养影响病原体应激反应的原因和机制。