SloR 与变形链球菌 mntH 启动子结合的协同作用：揭示龋齿致病菌金属离子稳态调控机制

本文聚焦变形链球菌（S. mutans），发现其 MntH 和 SloABC 锰转运系统功能冗余且具补偿性。SloR 可与 mntH 启动子区域的两个 SREs 结合，协同抑制转录。该研究为理解变形链球菌金属离子稳态调控及开发抗龋齿疗法提供关键依据。

　　### 研究背景
变形链球菌（Streptococcus mutans）是牙菌斑微生物群落的一员，在饮食中糖分充足时，它能发酵产生酸性副产物，降低牙菌斑 pH 值，进而引发龋齿。过渡金属如 Mn²⁺和 Fe²⁺对细菌在哺乳动物宿主中的生存和持续存在至关重要，但金属离子过量积累会对细胞有毒性，因此细菌需要严格调控金属离子的摄取。

变形链球菌主要通过 sloABC 操纵子编码的锰 ABC 型转运体摄取锰，该过程受 SloR 调节。SloR 是一种 25kDa 的转录因子，属于白喉毒素阻遏物（DtxR）家族的金属调节蛋白。当 Mn²⁺充足时，它与 SloR 结合，促进 SloR 同源二聚化并与 sloABC 启动子区域的回文 “SloR 识别元件”（SREs）结合，抑制 sloABC 基因转录，防止细胞内 Mn²⁺积累过多；当 Mn²⁺缺乏时，sloABC 转录去抑制，细胞可从外部环境摄取锰。

此前研究还发现，变形链球菌中存在一种辅助锰转运体 MntH，由 mntH 基因编码，属于 NRAMP 样 Mn²⁺特异性通透酶，与 SloABC 系统独立又协同工作。已有研究表明 mntH 属于变形链球菌 SloR 调控子，但 SloR 与 mntH 启动子区域的相互作用及 MntH 和 SloABC 介导的锰稳态协调机制尚未完全明确。

材料和方法

1. 细菌菌株、质粒和引物：实验使用多种变形链球菌菌株，如野生型 UA159 及衍生菌株等。引物和寡核苷酸根据 NCBI 中变形链球菌 UA159 基因组参考序列设计，购自 Eurofins Genomics。
2. 细菌培养：变形链球菌在 37°C、5% CO₂条件下，于 Todd-Hewitt 肉汤（THB）或添加 0.3% 酵母提取物的 THB（THYE）中静置培养。根据实验需求，培养基中会添加相应抗生素或其他物质。
3. ⁵⁴Mn 摄取实验：培养野生型及突变株至对数前期，加入⁵⁴Mn 或对照物质，孵育后离心分离细胞和上清，通过液体闪烁计数测定上清中⁵⁴Mn 的计数每分钟（cpm），并对对照样品进行活菌计数。
4. 核酸分离：按照既定方案从变形链球菌细胞中分离染色体 DNA 和总完整 RNA。
5. 5'-RACE：使用总 RNA 和 Invitrogen 5'-RACE 试剂盒，通过特定引物进行逆转录和 PCR 扩增，确定 mntH 转录起始位点及预测启动子元件位置，测序结果与 UA159 参考基因组比对。
6. DNase I 足迹法：PCR 扩增包含 mntH 启动子区域的 291bp 扩增子，进行末端标记和纯化。将纯化的 SloR 蛋白与结合缓冲液孵育，加入标记的扩增子，再用 DNase I 处理，经一系列操作后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。
7. 电泳迁移率变动分析（EMSA）：设计引物或寡核苷酸生成覆盖 mntH 启动子区域的靶探针，进行 PCR 扩增、纯化和末端标记。制备结合反应混合物，加入不同浓度 SloR 蛋白，设置对照，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影。
8. 构建变形链球菌 mntH SRE 变异株：利用无标记诱变方法，通过重叠延伸 PCR（OE-PCR）构建含 IFDC2 盒的线性构建体，转化至 UA159，经等位基因交换获得突变株，通过 PCR 和测序验证。
9. 半定量实时 PCR（qRT-PCR）：从不同菌株培养物中提取总 RNA，评估质量后逆转录为 cDNA，以 cDNA 为模板进行 qRT-PCR，测量 mntH 表达，实验重复三次，每次重复三次，并以 hk11 基因表达作归一化处理。
10. 变形链球菌 mntH 突变株的表型特征分析：包括结晶紫释放试验、生长测定试验、扫描电子显微镜观察和生物膜干涉技术（BLI）。结晶紫释放试验用于评估生物膜生物量；生长测定试验监测菌株生长；扫描电子显微镜观察生物膜结构；BLI 用于分析 SloR 与探针的结合相互作用。

实验结果

1. 变形链球菌 MntH 和 SloABC 锰转运系统冗余且具补偿性：⁵⁴Mn 摄取实验表明，mntH/sloC 双突变体中⁵⁴Mn 积累显著高于野生型和 sloC 单突变体，说明 MntH 和 SloABC 系统是变形链球菌锰摄取的关键系统。结晶紫释放试验和扫描电子显微镜结果显示，mntH/sloC 双突变体生物膜生物量显著降低，但单突变体与野生型生物膜生物量无显著差异，且生物膜结构相似，进一步证明两个系统的补偿作用。
2. 变形链球菌 mntH 启动子区域的特征：通过 5'-RACE 实验确定 mntH 转录起始于 ATG 起始密码子上游 32bp 的腺苷酸残基，据此预测出 - 10 和 - 35 启动子元件，-10 元件与原核生物规范序列一致，-35 元件与保守序列有一个核苷酸差异。
3. 变形链球菌 mntH 基因的调控涉及 SloR 与 mntH 启动子区域两个 SREs 的直接结合：EMSA 实验证实 SloR 可直接结合 206bp 的 mntH 启动子片段，结合具有金属离子依赖性。进一步实验确定 SloR 结合位点为 SRE1 和 SRE2，SRE1 与 - 35 启动子元件重叠，SRE2 位于 SRE1 上游 4bp 处。DNA 足迹实验显示 SloR 保护的区域包含 SRE1 和 SRE2，可容纳至少两个 SloR 同源二聚体结合。BLI 实验表明 SloR 与 SRE1 的结合亲和力高于 SRE2。
4. SRE1 和 / 或 SRE2 的突变在体内去抑制变形链球菌 mntH 基因的转录：qRT-PCR 研究发现，SRE1 突变体 GMS2027 中 mntH 转录去抑制约 4.5 倍，SRE2 突变体 GMS2028 中转录去抑制近 3 倍，双突变体 GMS2029 中转录去抑制超过 3 倍，证明 SRE1 和 SRE2 对 SloR 结合和 mntH 基因调控至关重要。
5. SRE 中反向重复序列（IRs）之间的间隔序列对 SloR-SRE 结合很重要，但不充分：EMSA 实验表明，改变 SRE1 间隔序列会消除 SloR-SRE1 结合的条带位移，且仅含 SRE1 间隔序列的探针不能与 SloR 结合，说明间隔序列对 SloR 结合重要，但单独存在不足以介导 SloR-SRE 相互作用。

讨论

本研究表明，变形链球菌存在至少两条冗余的锰摄取途径，由 SloABC 和 MntH 系统介导，有助于维持细胞内 Mn²⁺稳态，适应口腔环境。SloR 与 mntH 启动子区域的结合具有协同性，优先结合 SRE1，再与 SRE2 结合。SloR 与 SRE 的结合可能并非完全依赖序列，SRE 间隔序列影响 DNA 构象，进而影响 SloR 与 DNA 的结合亲和力。

这些发现扩展了对 SloR 金属调节基因组的理解，为开发针对 SloR-DNA 结合界面的治疗方法提供理论基础，有望缓解或预防变形链球菌引起的龋齿疾病。