新型艰难梭菌毒素 A 和 B 诊断测试性能大揭秘：基于潜在类别分析的深度探索

本文通过潜在类别分析评估多种艰难梭菌（Clostridioides difficile，CD）诊断测试性能。艰难梭菌感染（CDI）诊断困难，核酸扩增测试（NAAT）特异性欠佳，酶免疫测定（EIA）敏感性低。研究发现新型 SIMOA 毒素 EIA 敏感性优于传统 EIA，对 CDI 诊断意义重大。

　　

艰难梭菌感染诊断现状及研究背景

艰难梭菌（Clostridioides difficile，CD）是引发加拿大及全球医疗保健相关感染性腹泻的关键因素。准确、快速地诊断艰难梭菌感染（Clostridioides difficile infection，CDI），对及时治疗和防控传播极为重要。然而，当前 CDI 的诊断颇具挑战。

在众多检测方法中，细胞毒性中和试验（cell cytotoxicity neutralization assay，CCNA）虽与临床结果关联紧密，被视为 CDI 检测的优质选择，但它耗时久、标准化难度大，难以在临床实验室常规开展。核酸扩增测试（Nucleic acid amplification test，NAAT）常被用于检测粪便中的毒素 B 基因，以诊断 CDI，不过，由于存在 CD 无症状定植（CD asymptomatic colonization，CD-AC）的情况，其对 CDI 诊断的特异性并不理想。相反，检测 CD 毒素的酶免疫测定（enzyme immunoassay，EIA）虽特异性高，但敏感性较低，报道显示其敏感性仅在 33 - 65% 之间。

为应对这一难题，研究人员借助单分子阵列（single - molecule array，SIMOA）技术开发出新型定量检测 CD 毒素 A 和 B 的方法。该技术检测分析物的能力强大，能检测到极低含量的目标物质。初步数据表明，SIMOA CD 毒素 A 和 B 酶联免疫吸附试验的敏感性比传统定性 CD 毒素 EIA 提高了 1000 倍，检测限分别低至 0.45 和 1.5 pg/mL，而传统定性 CD 毒素 EIA 的检测限在 0.8 - 2.5 ng/mL。本研究旨在评估多种诊断方法对 CDI 的诊断性能，为临床诊断提供更可靠的依据。

材料与方法

1. 研究对象招募：2018 年 3 月 15 日至 2020 年 8 月 31 日，加拿大魁北克省蒙特利尔市的两所大学附属医院（麦吉尔大学健康中心和犹太总医院）参与了此项研究。招募对象为 18 岁及以上、有粪便样本进行 CD 检测的患者。入选标准为 24 小时内至少出现三次水样便（布里斯托评分 5 - 7）且无其他明显病因。若患者有结肠造口术、接受过至少 24 小时针对 CDI 的特异性治疗或已参与过本研究，则被排除在外。虽未专门排除使用泻药的患者，但护士会避免提交此类患者的粪便样本进行 CD 分析。
2. 样本检测方法：收集参与者的粪便标本后，分别采用 CCNA、产毒培养、谷氨酸脱氢酶（glutamate dehydrogenase，GDH）EIA、NAAT、传统 CD 毒素 A 和 B EIA 以及新型 SIMOA 毒素 A 和 B EIA 进行检测。粪便样本需在采集后 24 小时内处理，若无法及时处理，则将多个等分样本仅冷冻一次至 - 80°C，避免反复冻融。
   • CCNA 和产毒培养按照标准方法操作。CCNA 需对粪便进行离心、过滤，然后将滤液以两种稀释度接种到微孔板的 MRC - 5 细胞上，若出现特征性细胞病变，再用 CD 抗毒素中和进行确认。产毒培养则先对粪便标本进行酒精冲击处理，然后接种到含 5% 马血和 0.1% 牛磺胆酸盐的环丝氨酸 - 头孢西丁 - 果糖琼脂上，培养 48 小时，通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（VITEK MS）确认分离株是否为 CD，再用 CCNA 检测 CD 分离株是否产生毒素 B。
   • NAAT 使用罗氏 cobas Cdiff Test，按照制造商的说明进行检测。GDH 和毒素 A、B 的检测使用 Vidas GDH 和 Vidas 定性毒素 A 和 B EIA（bioMérieux 公司），同样遵循制造商的操作指南。SIMOA 检测由 bioMérieux 公司完成，根据之前 Banz 等人的研究，SIMOA 毒素 A 和 B 定量 EIA 判定为阳性的阈值分别为 22.1 和 18.8 pg/mL。
3. 诊断标准与判定：患者满足以下任一标准即可诊断为 CDI：24 小时内出现至少三次水样至半水样便且无其他明显病因；有毒性巨结肠且 CD 检测呈阳性；慢性腹泻患者在无明显原因的情况下大便特征发生改变且 CD 检测呈阳性；内镜检查显示有假膜性结肠炎；组织病理学检查证实为 CD 结肠炎。由两名认证的传染病医生或护士从业者独立判定患者是否患有 CDI 或定植，他们可获取包括 NAAT 结果在内的所有临床信息，但对 CCNA、定性 CD 毒素 EIA、CD 产毒培养和 SIMOA 毒素 EIA 结果不知情。若出现分歧，则由另一位传染病医生进行裁决。对于每例死亡病例，也由两名医生独立判断 CDI 是否为死因、是否为促成死因或与死因无关，如有分歧，由第三位传染病医生解决。
4. 统计分析：构建多变量潜在类别模型，该模型考虑了每个观察测试与其测量指标之间的关联，以及测量指标与 CDI 目标状况之间的关系。测量指标的不同组合形成了四个潜在类别：CD 阴性、CD 定植（细菌存在）、CD 产毒菌株定植（毒素基因存在）和 CDI（毒素存在）。为避免测试准确性估计出现偏差，引入单个随机效应来调整同一受试者多个测试结果之间的依赖性。

采用贝叶斯方法，使用非信息先验分布来估计四个潜在类别的患病率，以及每个测试相对于目标状况和其他测量指标的敏感性和特异性。利用所有可用数据拟合模型，包括部分测试结果缺失的受试者数据，缺失结果通过插补处理。在 R 软件环境中使用 rjags 包进行贝叶斯推断。最后，将 SIMOA 毒素 A 和 B EIA 以及 NAAT 与 CCNA 作为参考方法直接比较，计算它们的敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值。

研究结果

1. 患者招募与基线特征：两所研究地点共邀请了 1000 名患者参与研究，其中 292 名患者拒绝，最终 708 名患者纳入研究。这些患者的基线特征显示，平均年龄为 63 岁（标准差 16.3），女性占比 50%，Charlson 合并症指数平均为 3.8（标准差 2.4）。在研究期间，有 4% 的患者有 CDI 病史，7% 的患者在标本采集当天使用过泻药，58% 的患者在采集当天使用过抗生素，70% 的患者在采集前 14 天使用过抗生素。研究期间总死亡率为 7.2%，其中因 CDI 导致的死亡率为 0.1%。
2. 检测方法的阳性率：毒素 B 基因 NAAT 的阳性率为 16.2%，CCNA 和产毒培养的阳性率分别为 9.7% 和 15.5%。EIA 方面，VIDAS GDH EIA 阳性率为 21.6%，VIDAS 毒素 A 和 B EIA 阳性率为 7.1%，SIMOA 毒素 A 和 B EIA 阳性率分别为 12.5% 和 11.8%。有 36 例（5%）粪便标本中，SIMOA 毒素 A 或 B EIA 呈阳性，但 CCNA 为阴性。
3. 常见检测结果模式与潜在类别概率：研究数据中观察到多种检测结果模式。708 例粪便标本中，69%（488 例）的标本所有诊断测试均为阴性，4.4%（31 例）的标本所有诊断测试均为阳性。还有部分标本呈现出不同的阳性和阴性组合，如 23 例标本 GDH EIA、NAAT 和产毒培养阳性，但 VIDAS 和 SIMOA 毒素 EIA 以及 CCNA 检测毒素为阴性；17 例标本培养分离出 CD 且 GDH EIA 阳性，但其他诊断测试均为阴性。针对每种结果模式，研究人员估计了其属于四个潜在类别的概率，并列出了符合 CDI 临床标准的患者数量。四个潜在类别的估计患病率分别为：CD 阴性 79%（95% 可信区间：0.76 - 0.82）；CD 非产毒菌株定植 3%（95% 可信区间：0.02 - 0.05）；CD 产毒菌株定植 4%（95% 可信区间：0.02 - 0.06）；CDI 14%（95% 可信区间：0.11 - 0.17）。
4. 各检测方法的敏感性和特异性：计算各诊断测试针对不同测量指标的敏感性和特异性，并给出 95% 可信区间。结果显示，在检测 CD 细菌方面，VIDAS GDH EIA 敏感性最高，达到 100%（95% 可信区间：0.98 - 1.00）；在检测 CD 毒素基因方面，NAAT 敏感性为 90%（95% 可信区间：0.85 - 0.94）；在检测 CD 毒素方面，SIMOA 毒素 A 和 B EIA 的敏感性分别为 76%（95% 可信区间：0.66 - 0.83）和 77%（95% 可信区间：0.67 - 0.84），均高于传统 VIDAS 毒素 EIA 的 48%（95% 可信区间：0.41 - 0.55）。在特异性方面，多数检测方法对各自测量指标的特异性都较高，接近或达到 100%。将 SIMOA 毒素 A 和 B EIA 以及 NAAT 与 CCNA 作为参考方法直接比较时，SIMOA 毒素 A EIA 敏感性为 0.84（95% CI：0.73 - 0.92），特异性为 0.95（95% CI：0.93 - 0.97）；SIMOA 毒素 B EIA 敏感性为 0.82（95% CI：0.71 - 0.90），特异性为 0.96（95% CI：0.94 - 0.97）；NAAT 敏感性为 0.93（95% CI：0.84 - 0.98），特异性为 0.92（95% CI：0.90 - 0.94）。但由于 CDI 患病率较低，NAAT 的阳性预测值较差，SIMOA 毒素 A 和 B EIA 的阳性预测值分别为 0.67（95% CI：0.58 - 0.75）和 0.70（95% CI：0.61 - 0.78）。

讨论

1. CD 定植与感染率：研究证实了 CD 定植现象的存在，研究人群中 CDI 的发生率为 14%（95% 可信区间：0.11 - 0.17），无毒素产生的 CD 定植率为 7%（95% 可信区间：0.04 - 0.10），这部分患者腹泻可能由其他原因导致。与现有文献报道的住院患者中 CD - AC 无症状定植率（7% - 18%）相符。
2. 检测方法性能分析：NAAT 和产毒培养检测产毒 CD 的敏感性约为 90%，但因其会检测到非产毒的定植菌株，导致对 CDI 检测的特异性和阳性预测值受到影响。本研究中，NAAT 检测产毒菌株的特异性为 99%（包括无症状定植），检测真正 CDI（有毒素产生）的特异性略低，为 95%，与文献报道相近。CCNA 检测 CDI 的特异性接近 100%，但敏感性仅 71%。例如，在 SIMOA 毒素 A 或 B EIA 检测出毒素的 97 例粪便标本中，CCNA 仅 61 例（63%）呈阳性。SIMOA 的敏感性也并非完美，CCNA 检测出毒素的 69 例标本中，SIMOA 毒素 B 检测仅 56 例（81%）呈阳性。传统 CD 毒素 A 和 B EIA 的敏感性较差，仅为 48%（95% 可信区间：0.41 - 0.55），与文献报道一致。而新型 SIMOA 毒素 A 和 B EIA 的敏感性显著高于传统定性 EIA，且优于 CCNA 的估计敏感性，同时保持了接近 100% 的特异性。
3. 检测方法局限性与临床意义：研究发现，毒素检测高度依赖实验室方法。本研究模型假设检测到任何量的 CD 毒素都表明存在 CDI，但少量毒素的临床意义尚不明确，可能反映的是定植情况。此外，CD 毒素 EIA 与非 CD 抗原的交叉反应可能导致假阳性和检测结果不一致，从而降低了模型中所有毒素特异性检测的计算敏感性。尽管 NAAT 总体测试特性较好，但由于 CDI 患病率低，其阳性预测值不佳。例如，在 115 例 NAAT 阳性的粪便标本中，仅 64 例（56%）CCNA 呈阳性。在多种检测方法呈阳性但毒素检测均为阴性的情况下，患者患 CDI 的概率为 13%。SIMOA 毒素 A 和 B EIA 虽敏感性优于传统 EIA，甚至可能超过 CCNA，且检测周转时间短、易于标准化，但敏感性仍不足以单独作为检测方法，需与其他更敏感的检测方法（如 NAAT 或 GDH EIA）联合使用。而且，有研究报道 SIMOA 检测的毒素浓度无法区分 CDI 患者和定植者，其对 CDI 的预测能力是否与 CCNA 相当，还需进一步研究。
4. 研究模型优势与诊断建议：本研究采用的多变量潜在类别分析模型具有独特优势，与传统的两类模型不同，它能区分每个测试相对于其测量指标和目标状况的准确性。在 CDI 诊断中，不能仅依靠单一的实验室检测方法来区分 CD 定植和 CDI，因为现有检测方法都存在缺陷。临床诊断 CDI 时，需结合临床症状和实验室检查结果进行综合判断，目前仍缺乏高敏感性和高特异性的理想检测方法。

致谢

作者感谢所有参与研究的患者，以及参与研究的各机构的研究助理和技术人员，感谢他们在患者招募、数据收集、标本采集和处理等方面所做的工作。本研究得到了加拿大卫生研究院的支持。