超灵敏HBsAg检测揭示隐匿性乙肝病毒感染（OBI）相关突变特征及其分子机制

这篇研究通过超灵敏Lumipulse G HBsAg-Quant检测技术（LOD 0.005 IU/mL），系统分析了中国14省份血液样本中隐匿性乙肝病毒感染（OBI）的S区高频突变特征。研究首次鉴定出基因型B（GTB）17个位点和基因型C（GTC）16个位点的单突变及9种组合突变与OBI显著相关，并揭示T123A/C/K/S、P142L/R/S/T等突变通过降低HBsAg表达或分泌障碍（如K160R引起细胞内聚集）导致HBsAg检测逃逸。研究还发现商用试剂（如DiaSorin/Abbott/Roche）对部分突变体（如GTB-T123P、GTC-S114A/P）检测敏感性不足，为OBI机制研究和诊断试剂优化提供了新视角。

　　

ABSTRACT
隐匿性乙肝病毒感染（OBI）因血清HBsAg检测阴性但存在HBV DNA的特征而成为公共卫生挑战。本研究采用超灵敏Lumipulse G HBsAg-Quant检测（灵敏度0.005 IU/mL）对中国32家血站的270例OBI样本重新分类，发现50.00% GTB和43.22% GTC样本实际为HBsAg低水平阳性（Fujirebio+ OBI）。通过对比Fujirebio? OBI与HBsAg+组，首次系统揭示了GTB中T123A/C/K/S、P142L/R/S/T等17个高频单突变及9种组合突变（如K160R+V168A）与OBI显著相关，GTC中则鉴定出E2G、M103I等16个单突变和R160K+C221Y等9种组合突变。

INTRODUCTION
全球约3.16亿慢性HBV感染者中，OBI因常规检测漏诊可能引发输血风险和肝病进展。传统HBsAg检测（如Abbott ARCHITECT，LOD 0.021 IU/mL）的局限性促使超灵敏检测技术（如Fujirebio/ARCHITECT Next）的应用。研究团队前期发现18.2%-61.5%传统OBI样本经超灵敏检测呈阳性，提示突变分析需基于更精准的HBsAg分类。

MATERIALS AND METHODS
样本来自中国14省份32家血站，通过超离心（171,200×g）和巢式PCR增强测序效率。采用位点定向突变构建GTB（B4）和GTC（C2）的全基因组突变体，转染Huh-7细胞后，通过Western Blot、四种商用试剂（DiaSorin/Abbott/Roche/Fujirebio）检测胞内外HBsAg。利用Phyre2和ExPASy ProtScale分析突变体亲水性和跨膜分布。

RESULTS

1. 血清学特征：Fujirebio? OBI组HBV DNA Ct值（中位数34.1）显著高于Fujirebio+组（30.6），且抗-HBs水平更高（5.21 vs 0.96 mIU/mL），提示病毒载量和免疫压力差异。
2. 突变谱分析：GTB中T123C突变导致DiaSorin检测完全失效（HBsAg降至WT的<25%），而GTC中S114A/P影响Fujirebio检测。Western Blot证实P142I/K/L/R在Abbott/Roche中抗原性显著降低。
3. 机制解析：
   • 表达缺陷：GTB中T123A/C/K/S、D144G和GTC中M103I突变同时降低胞内外HBsAg，提示蛋白稳定性受损。
   • 分泌障碍：GTB-K160R（位于MHR-TMD3交界）通过破坏亲水性（谷氨酸→精氨酸）引起胞内聚集；GTC-E2G因疏水性增强（ΔG=?3.1）导致分泌效率下降50%。
   • 抗原性改变：S132F突变使MHR疏水性增强，反而促进HBsAg分泌（胞外水平增加150%）。

DISCUSSION
研究首次通过超灵敏检测界定真性OBI突变谱，揭示三类分子机制：

1. 检测逃逸：7.29% GTB和20.59% GTC毒株因MHR突变（如T123P、S114A）导致商用试剂漏检；
2. 表达调控：连续突变（P142L-R-S-T→T143M→D144G）形成“低表达热点区”；
3. 分泌异常：跨膜区相邻突变（如K160R）通过改变蛋白拓扑结构（胞外段减少40%）诱发内质网应激。

临床意义：

1. 建议高流行区采用超灵敏检测（如Fujirebio）联合核酸筛查；
2. 优化试剂需覆盖高频突变（如GTB-K141C、GTC-R160K+C221Y）；
3. 突变体胞内聚集可能促进肝癌发生（如K160R上调线粒体自噬）。

局限性：

1. 缺乏体内验证和纵向数据；
2. 未涵盖其他基因型（如A/D）；
3. 细胞模型与血清基质存在差异。未来研究可结合冷冻电镜解析突变体空间构象。