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本文构建并优化了基于酶促重组酶扩增（ERA）与 CRISPR/Cas12a 系统的白色念珠菌检测体系。通过对比多种扩增方法，选定 ERA 与 CRISPR/Cas12a 联用，从两步法优化为温控一步法。该方法灵敏度高、特异性强、操作简便，为白色念珠菌的临床快速诊断提供了新工具。
### 研究背景
侵袭性念珠菌病（IC）是临床上常见的真菌感染疾病，在免疫功能低下的患者中尤为高发，具有发病率高、死亡率高和治疗成本高的特点。白色念珠菌（
C. albicans）是 IC 的主要病原体，约占病例的 65% - 70%。它通常与人体共生，但在免疫系统受损或黏膜微生物平衡被破坏时，会引发各种感染。
目前，血液培养是诊断白色念珠菌感染的金标准，但存在培养时间长、灵敏度有限的问题。其他诊断方法，如甘露聚糖 / 抗甘露聚糖免疫球蛋白 G 检测、（1,3）-β-D - 葡聚糖检测（G-test）和定量 PCR（qPCR）等，在某些实验室有应用，但在血培养阴性的深部念珠菌病诊断中未得到广泛评估，且各有缺点，如诊断时间长、特异性或灵敏度欠佳等。因此，开发能提高灵敏度和特异性的新型诊断技术至关重要。
近年来，CRISPR/Cas 系统（成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白）因其检测时间短、特异性高，在即时检测（POCT）中展现出显著优势。在 CRISPR RNA（crRNA）的引导下，该系统可特异性识别靶 DNA，激活来自毛螺旋菌科细菌的 Cas12a 蛋白（LbCas12a），LbCas12a 具有顺式和反式切割活性，能将核酸靶标信号转化为可检测的输出信号，可与核酸扩增系统联用。然而，多数联用方法存在反应步骤多、易受气溶胶污染、灵敏度下降或反应时间延长等问题。为此，研究人员开发了多种单管反应系统，但部分系统存在优化复杂、重复性和稳定性欠佳的情况。本研究旨在开发一种温控、自动化的一步法 ERA - CRISPR/Cas12a 技术，用于快速、简便且低成本地检测白色念珠菌。
材料和方法
- 材料和试剂：重组质粒、引物等由相关生物技术公司合成或提供，各种酶、试剂盒及化学试剂购自相应公司，实验菌株来自实验室资源或医院。
- 重组质粒构建和基因组 DNA 提取：合成含白色念珠菌内部转录间隔区 2（ITS2）基因序列的重组 pUC19 质粒，提取后进行浓度测定和稀释。同时培养白色念珠菌及其他菌株，提取基因组 DNA 并稀释，储存备用。
- 转录和制备 crRNA：针对白色念珠菌 ITS2 基因和 Cas12a 原间隔相邻基序（PAM）识别位点设计 crRNA，通过体外转录制备。设计 Target Antisense Oligo 与 Cas12a Sense Oligo 退火生成转录模板，转录后纯化并定量 RNA，储存于 - 80°C。
- 引物设计和筛选：分别用 Primer Premier 5.0 和 Primer Explorer V5 软件设计用于 PCR、ERA 和 LAMP 扩增白色念珠菌 ITS2 基因的引物。通过不同的实验方法和检测手段筛选出最佳引物。
- 顺式切割和反式切割检测：进行顺式切割检测以确定 LbCas12a 对特定双链 DNA（dsDNA）靶标的切割能力，通过反式切割检测评估其对非特异性单链 DNA（ssDNA）探针的切割能力。
- CRISPR/Cas12a 反应系统优化：优化 ssDNA 和 LbCas12a/crRNA 复合物的浓度，以提高系统的有效性和成本效益。
- 两步法 CRISPR/Cas12a 荧光检测：将 PCR、ERA 或 LAMP 扩增产物加入含 LbCas12a、crRNA 和 ssDNA 报告探针的反应体系中，进行实时荧光监测。
- 一步法 ERA - CRISPR/Cas12a 检测系统构建：使用不同比例的液体和固体石蜡混合蜡，确定合适的熔点以分离 ERA 和 CRISPR 反应。构建反应体系，在实时 PCR 系统中进行反应。
- 一步法 ERA - CRISPR/Cas12a 系统的临床评估：用医院提供的唾液核酸样本，添加白色念珠菌基因组材料模拟临床检测条件，评估系统的有效性。
结果与讨论
- PCR、ERA 和 LAMP 引物筛选：通过琼脂糖凝胶电泳和荧光检测分析，分别确定了 PCR 引物 3、ERA 引物 3 和 LAMP 引物 3 为各自方法的最佳引物，它们在扩增效率和特异性上表现更优。
- CRISPR/Cas12a 顺式和反式切割验证：PCR 扩增含 PAM 位点的靶片段，经 CRISPR/Cas12a 系统作用后，靶片段被切割为两个片段，证实了 LbCas12a 的顺式切割活性。在反式切割检测中，只有完整反应组分的实验组显示强荧光信号，验证了其反式切割活性，且表明形成三元复合物是激活酶并诱导切割活性的关键。
- 基于 CRISPR/Cas12a 的荧光检测系统优化：优化 ssDNA 浓度发现，200 nM 时荧光强度达到最大且不再增加。在固定 crRNA 浓度为 250 nM 的情况下，调整 LbCas12a 浓度，确定 200 nM 为能达到最大荧光强度的最低浓度。
- 两步法 CRISPR/Cas12a 方法的建立和灵敏度分析：建立两步法 CRISPR/Cas12a 检测白色念珠菌的方法，评估不同扩增方法与 CRISPR 系统联用的灵敏度。结果显示，ERA - CRISPR/Cas12a 方法灵敏度最高，其检测限（LOD）为 1×101 copies/μL，用白色念珠菌纯培养基因组验证时，LOD 可达 100 ag/μL，整个过程约 50 分钟。
- 一步法 ERA - CRISPR/Cas12a 检测：开发一步法 ERA - CRISPR/Cas12a 检测方法，用特定比例的混合蜡控制反应温度。实验确定液体与固体石蜡比例为 10:7 时，熔点为 45°C 适宜反应。该方法的 LOD 为 100 ag/μL，整个过程约 40 分钟，与两步法灵敏度相当，但简化了流程，降低了污染风险，检测速度更快。用多种真菌基因组验证其特异性，只有白色念珠菌基因组产生强荧光信号，表明无交叉反应。
- 一步法 ERA - CRISPR/Cas12a 对临床唾液样本的检测：用临床唾液核酸样本评估一步法的临床适用性，结果显示所有阳性样本均能检测到荧光，而阴性对照和无模板对照无荧光，表明该方法在临床检测中灵敏度高、特异性强、准确性好。
结论
早期识别和治疗念珠菌病至关重要，目前传统培养方法存在检测周期长、步骤繁琐等局限性，急需快速诊断技术。本研究成功建立了温控一步法 ERA - CRISPR/Cas12a 检测系统，该系统在 37°C 扩增 10 分钟，扩增试剂与检测试剂反应 20 分钟，全过程 30 分钟。整个过程无需开盖，减少了气溶胶污染，检测限可达 100 ag/μL，与两步法灵敏度一致，特异性和抗临床核酸干扰能力强，无交叉反应现象。但该检测系统也存在局限性，目前仅针对白色念珠菌检测，后续将进行改进，开发多重核酸检测技术，为早期诊断和监测提供更多帮助。
