基于 MALDI-TOF-MS 检测艰难梭菌感染中毒素 B 酶活性的概念验证研究：助力精准诊疗

推荐阅读：本文聚焦艰难梭菌（Clostridioides difficile）感染诊断难题。通过优化基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）检测法，以 RhoA 蛋白为底物，间接测定毒素 B 酶活性。该法无需病原菌培养，有望补充现有诊断技术，评估感染严重程度。

　　

研究背景

在临床微生物学领域，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）已成为重要工具，用于病原体鉴定和抗生素耐药性测定。不过，其使用存在一定限制，如无法直接检测样本中的病原体，培养纯菌落耗时耗力，检测厌氧菌时流程更为复杂。

艰难梭菌（Clostridioides difficile）是一种重要的医院感染病原体，可引发腹泻，严重时导致危及生命的结肠炎。它是革兰氏阳性、严格厌氧的芽孢杆菌，其感染（CDI）临床表现多样，从无症状携带、轻中度腹泻到结肠炎，甚至可能导致结肠穿孔、败血症和死亡。在欧洲，每年约有 12 万例 CDI 病例，死亡率达 3%；在美国，每年近 50 万例，近 3 万人死亡。

目前，艰难梭菌感染的诊断方法主要包括核酸扩增检测（NAAT）和免疫分析（IA）。NAAT 能快速提供厌氧物种的定量数据，IA 则用于检测谷氨酸脱氢酶（GDH）、毒素 A 和毒素 B 等。但这些方法存在局限性，如不同菌株的毒素 A 和 B 活性存在差异，检测到的毒素浓度与疾病严重程度不一定相关。而且，其他细菌也可能产生类似毒素，干扰诊断。此外，传统检测方法中，细胞毒性检测（CTA）和产毒培养（TC）虽能评估病原体效力，但因耗时、费力且需要专业设备和人员，未被常规使用。因此，开发一种能快速检测艰难梭菌感染且评估感染潜在严重程度的方法至关重要。

实验设计

本研究旨在建立一种基于 MALDI-TOF-MS 的概念验证检测方法，用于间接测定人类粪便中艰难梭菌毒素 B 的酶活性。研究人员使用重组制备的带有生物素标签的 RhoA 蛋白作为底物，该底物可附着在 NeutrAvidin MALDI 芯片上。粪便样本中的毒素 B 会使芯片上的 RhoA 底物发生酶促糖基化，反应产物通过 MALDI-TOF-MS 直接检测。整个检测过程在 NeutrAvidin MALDI 芯片上原位进行，该芯片采用独特的表面修饰技术制备。

实验方法

1. 材料准备：实验所用的化学试剂和材料，如铟锡氧化物（ITO）涂层玻璃载玻片、重组毒素 B、NeutrAvidin 蛋白等，均购自相应公司。20 例患者的粪便样本由皮尔森医学院和大学医院微生物科提供，这些样本来自 2023 年 8 - 9 月怀疑由艰难梭菌感染引起腹泻的患者，且已通过常规诊断方法（GDH、毒素 A 和毒素 B 荧光免疫分析及 LAMP 检测）进行初步诊断。
2. 芯片制备：利用环境离子软着陆装置，在 ITO 玻璃载玻片上制备 NeutrAvidin 亲和芯片。通过贴纸掩模确定 NeutrAvidin 阵列的几何形状，将 0.6mg/mL 的 NeutrAvidin 溶液在特定条件下电喷雾沉积，随后用去离子水洗涤，去除多余物质。
3. 艰难梭菌培养：艰难梭菌分离株在艰难梭菌选择性琼脂上，于厌氧环境（37°C，48 小时）培养。用于毒素检测时，用 MALDI Biotyper Sirius System 鉴定后的菌落接种到 Oxoid Fastidious Anaerobe Broth 中，再在厌氧环境下培养 24 小时，离心收集细菌用于后续实验。
4. 生物素标记的 RhoA 重组蛋白表达：对人 RhoA 序列进行修饰，连接 avi - tag 接头以便 BirA 生物素连接酶进行生物素化。使用 pGex - 6p - 1 表达质粒构建最终载体，在 BL - 21 Bir.A 产生的大肠杆菌中，经异丙基 β - D - 1 - 硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导表达生物素标记的 GST - RhoA 融合蛋白。通过 GST - Sepharose 纯化，PreScission 蛋白酶切割，获得纯化的 RhoA - 生物素蛋白，储存于 - 80°C。
5. 原位富集生物素标记的 RhoA：将浓度为 0.5mg/mL 的 RhoA - 生物素溶液 1μL 滴加到 NeutrAvidin 修饰的 MALDI 芯片的每个斑点上，在湿度箱中孵育 60 分钟，随后用特定缓冲液和去离子水洗涤，室温干燥。
6. 与重组毒素 B 的原位酶促反应：优化实验时，将粪便标本稀释至 1%（wt/wt），加入不同浓度的重组毒素 B（20 - 0.006μg/mL 的 5 倍稀释系列），在含有多种离子和蛋白酶抑制剂的反应缓冲液（pH7.5）中孵育。将 1μL 各样本滴加到固定有 RhoA 蛋白的 MALDI 表面，37°C 孵育 1 小时后，洗涤芯片并干燥，每个斑点覆盖 HCCA 基质。在检测患者样本时，样本同样稀释为 1%，但不添加重组毒素 B，20 例患者样本以技术重复的方式，每点 1μL 滴加到芯片上。
7. MALDI 质谱检测与数据处理：使用 Autoflex speed MALDI - TOF 质谱仪，在正线性模式下检测 MALDI 芯片上的样本。设置部分样本随机行走，每个斑点积累 7000 次激光照射，采集 m/z 范围为 6000 - 300000 Th 的质谱数据，激光频率 500Hz，探测器增益 2860V。通过计算 RhoA 底物糖基化形式的转换程度（Econv）评估方法，Econv计算公式为Econv=Iintact+IglycoIglyco，其中Iglyco为修饰后 RhoA 蛋白在 MALDI MS 谱中的信号强度，Iintact为完整 RhoA 的信号强度。

实验结果

1. RhoA 底物的纯化与质谱分析：去除 GST 标签后，通过快速蛋白质液相色谱（FPLC）凝胶过滤柱纯化 RhoA。色谱图中 11 - 13 分钟的馏分经电喷雾电离傅里叶变换离子回旋共振（FT - ICR）质谱分析，确认其为所需纯度的 RhoA - 生物素，可用于后续实验。测得其单同位素质量为 24959.625Da，与理论值误差为 0.6ppm。
2. 原位酶促检测的优化：测试多种 MALDI 基质后，发现 α - 氰基 - 4 - 羟基肉桂酸（HCCA）基质效果最佳，能在提高离子强度的同时减少基质加合物的形成。实验还发现，固定在 NeutrAvidin 芯片上的底物 RhoA 比直接添加的游离 RhoA 更稳定，在洗涤缓冲液中添加 n - 十二烷基 - β - D - 麦芽糖苷（DDM）和Mg2+以及使用蛋白酶抑制剂混合物可进一步提高稳定性。反应时间在 30 - 80 分钟时，能在大多数粪便样本中检测到毒素活性。优化后的工作流程为：先制备 NeutrAvidin 芯片并固定 RhoA - 生物素底物，然后将粪便样本在反应缓冲液中孵育 30 - 80 分钟（37°C），使底物发生酶促反应，接着洗涤并覆盖 HCCA 基质，最后用 MALDI - TOF-MS 检测。
3. 毒素 B 活性的质谱检测：使用 MALDI - TOF 质谱仪在正线性模式下，通过检测 m/z 为 25063 的完整 RhoA 蛋白离子和 m/z 为 25225 的糖基化 RhoA 离子，监测样本中毒素 B 的存在。制备重组毒素 B 的稀释系列，确定该方法在复杂基质（粪便）中检测毒素 B 活性的检测限。当毒素 B 浓度为 32ng/mL 时，糖基化 RhoA 离子的平均信噪比为 17。监测双电荷离子 m/z 12534（完整 RhoA）和 12615（糖基化 RhoA），其分辨率和强度更好。实验还进行了变异测试，将重组毒素 B 分别以 4μg/mL 和 0.8μg/mL 的浓度添加到粪便提取物中，每个浓度在两个芯片上各进行 20 次技术重复，计算 RhoA 糖基化水平。结果显示，芯片 1 在 4μg/mL 和 0.8μg/mL 毒素 B 浓度下的变异系数（CV）分别为 6%（SD 0.05）和 8%（SD 0.06）；芯片 2 在相应浓度下的 CV 分别为 8%（SD 0.06）和 12%（SD 0.08）；两个芯片之间的 CV 在 4μg/mL 和 0.8μg/mL 毒素 B 浓度下分别为 7%（SD 0.05）和 10%（SD 0.07）。
4. 优化检测方法在疑似 CDI 患者样本中的应用：使用优化后的检测方法对 20 例疑似 CDI 患者的粪便样本进行检测。这些样本已在医院通过 IA 检测（同时检测 GDH、毒素 A 和毒素 B）或 LAMP 检测（针对毒素 A 和毒素 B，仅在 IA 检测中 GDH 阳性但毒素 A 和 B 阴性时进行）。MALDI 检测在 4 例样本（#2、#3、#6 和 #18）中检测到毒素 B 活性，其中 2 例（#3 和 #6）与医院检测结果一致。在另外 3 例样本（#1、#5 和 #9）中，MALDI 未检测到毒素活性，尽管医院检测为阳性。对检测到毒素 B 活性的 4 例样本（#2、#3、#6 和 #18）进行重复检测，计算完整 RhoA 和糖基化 RhoA 的修饰比，发现该比值在重复检测中具有可重复性，但不同样本的转换程度不同，表明样本中毒素 B 活性存在差异。

研究结论

本研究成功开发了一种基于 MALDI-TOF-MS 的概念验证检测方法，能够检测艰难梭菌毒素 B 对底物 RhoA 蛋白的糖基化作用，从而间接测定毒素 B 的酶活性。该方法克服了传统 MALDI 生物分型需要耗时培养的缺点，可直接在粪便样本中检测毒素 B 活性。虽然检测结果与医院现有检测方法不完全一致，存在 2 例假阳性和 3 例假阴性结果，但这可能是由于样本中毒素 B 活性不同或毒素来源不同导致。本检测方法旨在作为现有检测工具的补充，提供关于毒素 B 活性的信息，帮助更全面地评估感染严重程度和患者状况。

不过，该检测方法也存在局限性，如受粪便样本复杂基质影响，RhoA 蛋白在样本中的稳定性会影响检测灵敏度，其稳定性取决于孵育时间。未来需要进一步优化和大规模评估该方法，以提高其在临床诊断中的应用价值。同时，由于该方法检测的是毒素活性，有望识别通过水平质粒转移获得艰难梭菌毒素产生基因的其他产毒细菌物种。而且，多数临床微生物实验室已配备可用于该检测的 MALDI-TOF Biotypers，无需额外修改，检测流程无需培养，具有时间高效性，结合现有设备可实现自动化和高通量检测。