揭秘猪链球菌关键基因：为新型抗菌药物研发点亮 “导航灯”

本文通过转座子插入测序（Tn-seq）和基因组规模代谢模型（GEM）构建，分析猪链球菌（Streptococcus suis）的必需基因，发现 244 个候选必需基因，其中 101 个为潜在抗菌药物靶点，为新型抗菌药物研发提供重要参考。

　　### 一、研究背景
抗菌药物耐药性（AMR）已成为全球关注的重大挑战，若不加以控制，预计到 2050 年将导致超 1000 万人死亡。开发具有新靶点和作用机制的抗生素迫在眉睫，细菌必需基因因其对细菌生长和生存不可或缺，且具有较高保守性，成为极具潜力的抗菌药物靶点。

转座子（Tn）是功能基因组研究的重要工具，结合高通量测序的转座子测序（Tn-seq）可高效鉴定重要基因。基因组规模代谢（GEM）模型构建能在计算机上模拟生物体内的代谢反应，用于分析细胞表型、预测必需基因等。

猪链球菌是一种新兴的人畜共患病病原菌，对全球公共卫生和养猪业构成严重威胁，且其耐药性呈上升趋势，但目前尚无关于猪链球菌必需基因的研究报道。本研究旨在利用 Tn-seq 和 GEM 构建，鉴定猪链球菌的必需基因，挖掘潜在的抗菌药物靶点。

二、材料与方法

1. 细菌菌株、生长条件和质粒构建：选用猪链球菌 SC19 菌株，该菌株是 2005 年中国四川省疫情爆发时分离出的临床 2 型血清型菌株，GenBank 登录号为 NZ_CP020863.1。猪链球菌在含 5% 灭活新生牛血清的胰蛋白大豆肉汤（TSB）或胰蛋白大豆琼脂（TSA）平板上，37°C、180 rpm 振荡培养；大肠杆菌 DH5α 用于质粒扩增，在溶原肉汤（LB）或 LB 琼脂平板上 37°C 培养。构建用于猪链球菌转座的质粒 pSET4s-Tn，它包含 Himar1 转座酶表达盒、含红霉素抗性盒的 Tn 等元件。
2. Tn 突变体插入位点鉴定：采用半随机两步 PCR（ST-PCR）确定单个 Tn 突变体的插入位点。提取突变体基因组 DNA，经两轮 PCR 扩增后纯化测序，利用 BLAST 将测序结果与猪链球菌 SC19 基因组比对确定插入位点。随机选取部分突变体进行全基因组测序，以确定 Tn 插入拷贝数。
3. 猪链球菌转座子突变体文库构建：将 pSET4s-Tn 质粒通过电穿孔法转化到猪链球菌中，经特定温度培养和抗生素筛选，获得候选 Tn 突变体。计算转座子插入效率后，将突变体菌落收集保存。
4. Tn 突变体文库测序：提取 Tn 突变体文库的基因组 DNA，进行片段化、末端修复、加 A 尾等操作，连接 Illumina 通用接头，经两轮 PCR 扩增构建测序文库，在 Illumina NovaSeq 平台测序，原始数据提交至 NCBI 序列读取存档数据库。
5. Tn-seq 数据分析：使用 SeqKit 软件对原始测序数据进行初步统计，利用 TRANSIT 软件包中的 TPP 工具筛选序列并与基因组比对，通过 Gumbel 分析预测必需基因。
6. 基因同源性分析：在 UniProt 网站上使用 BLAST 将猪链球菌 SC19 必需基因与人类、小鼠、猪的基因组进行比较，基因同一性低于 40% 的通常被视为安全的药物靶点。同时，利用 NCBI BLAST-2.14.0 + 与其他链球菌及大肠杆菌的核心基因组进行同源性比较，并通过 KEGG BlastKOALA 进行注释，KEGG Mapper 进行富集分析，eggNOG Mapper v.2 进行直系同源群（COG）聚类分析。
7. 基因组规模代谢模型构建和 FBA 分析：利用 ModelSEED 数据库构建猪链球菌 SC19 的代谢网络模型 SS-SC19-MS1，使用 COBRApy 工具包进行通量平衡分析（FBA），以生物量生产最大化为目标函数预测必需基因，Fluxer 用于模型可视化。

三、研究结果

1. 猪链球菌高效转座子诱变系统的构建：成功构建新的转座子诱变质粒 pSET4s-Tn，对随机选取的 20 个 Tn 突变体进行 ST-PCR 分析，发现 Erm^R随机插入到猪链球菌基因组不同位置的 T/A 位点。对 5 个突变体进行基因组测序，结果表明每个突变体仅含单拷贝 Tn。优化转座条件后，转座子诱变效率超 98%，成功构建高效转座子诱变系统。
2. 转座子诱变文库的构建与测序：利用上述诱变系统构建了约含 160,500 个 Tn 突变体的文库，测序后共鉴定出 21,746 个插入位点，1,771 个基因被 Tn 插入破坏，文库饱和度达 86.98%，表明 Tn 在猪链球菌基因组中随机且相对均匀地插入。
3. 候选必需基因分析：通过 Gumbel 分析预测出 150 个候选必需基因、1,572 个非必需基因、34 个短基因和 207 个不确定基因。KEGG 通路富集分析显示，必需基因主要参与碳水化合物代谢、氨基酸代谢、聚糖生物合成等代谢过程，以及翻译、复制和修复等遗传信息处理过程。COG 富集分析表明，大部分必需基因属于信息存储和处理类别。
4. 猪链球菌基因组规模代谢模型的构建和必需基因预测：构建的猪链球菌 SC19 基因组规模代谢模型 SS-SC19-MS1 包含 1,089 个反应、71 个交换反应、482 个基因、1,164 个代谢物和 163 条通路，可进行模拟并产生生物量。FBA 分析预测出 165 个必需基因，COG 聚类分析显示这些基因主要集中在翻译、核糖体结构和生物发生类别。
5. 潜在抗菌药物靶点分析：结合 Tn-seq 和代谢模型分析结果，获得 244 个候选必需基因，这些基因聚类到 18 个 COG 类别。与其他链球菌的必需基因比较，发现 123 个基因在四种链球菌菌株中均为必需，其中 101 个基因与宿主基因同一性低于 40%，可作为潜在抗生素靶点。这些靶点涉及翻译、复制、细胞壁生物合成等多个过程。与大肠杆菌 K-12 的必需基因比较，发现 72 个基因可作为潜在的广谱抗菌药物靶点。

四、讨论

本研究首次鉴定了猪链球菌 SC19 菌株的必需基因，为新型抗生素开发提供了有价值的信息。高效转座子诱变系统的建立是研究亮点之一，但该系统存在一定局限性，如较长的培养时间可能导致生长缓慢的突变体被淘汰。基因组规模代谢模型构建为预测细菌必需基因提供了精确高效的方法，但模型质量有待进一步优化。

Tn-seq 和 GEM 构建在预测必需基因方面虽强大，但均存在局限性。Tn-seq 可能因转座子插入位置导致基因功能误判，GEM 预测可能忽略调控机制和运输系统。因此，需用其他方法对这些必需基因进行进一步验证。

通过分析潜在抗菌药物靶点，发现除已知抗生素靶点外，还存在一些新的潜在靶点，如参与荚膜合成、氨基酸酰基 - tRNA 合成、脂质合成、细胞分裂和双组分系统的蛋白质。针对这些非传统靶点开发的抑制剂已显示出一定的抗菌活性，为药物研发提供了新方向。