甲醇诱导转录因子 Mpp1：调控甲基营养型酵母一碳代谢平衡的关键 “开关”

本文聚焦甲基营养型酵母（如 Candida boidinii、Komagataella phaffii），发现甲醇诱导转录因子 CbMpp1 和 KpMit1（CRMI 调控其表达），能协调多个甲醇诱导基因表达，实现一碳（C1）代谢平衡，为解析酵母甲醇代谢机制及优化异源蛋白生产提供关键依据。

　　### 研究背景
甲基营养型酵母，像 Komagataella phaffii（曾用名 Pichia pastoris）、Ogataea polymorpha（曾用名 Hansenula polymorpha）和 Candida boidinii 等，具备以甲醇为唯一碳源和能源生长的能力。因其甲醇诱导基因启动子调控严格且作用强，常被选作异源基因表达的宿主。

在甲醇代谢过程中，这类酵母会生成大量含甲醇代谢酶的过氧化物酶体，如醇氧化酶（AOD）和二羟基丙酮合酶（DAS），同时细胞质中的谷胱甘肽依赖型甲醛脱氢酶（FLD）、S - 甲酰谷胱甘肽水解酶和甲酸脱氢酶（FDH）等也会显著诱导表达 。甲醇先经 AOD 氧化成甲醛和 H₂O₂，甲醛作为甲醇代谢途径的关键中间产物，处于同化和异化两条代谢途径的分支点。在同化途径中，甲醛经 DAS 固定到木酮糖 5 - 磷酸上，生成二羟基丙酮和甘油醛 3 - 磷酸，用于合成细胞成分；在异化途径中，甲醛通过谷胱甘肽依赖的甲醛氧化途径进一步氧化为 CO₂。

甲醇代谢酶基因的表达受碳源调控，且在甲醇存在时会强烈诱导表达。例如，在 Komagataella phaffii 中，AOD 和 DAS 编码基因的转录水平在甲醇浓度为 0.001% - 0.1% 时上升，超过 0.1% 时下降，这种现象被称为浓度调节甲醇诱导（CRMI）。CRMI 不仅调控由 AOD 氧化甲醇生成的甲醛代谢通量，还在酵母适应自然环境中甲醇浓度变化（如叶表面甲醇浓度的昼夜波动）方面发挥关键作用。

若 C1 代谢失衡，会导致甲醛过度积累，对细胞产生毒性。所以，需根据环境中甲醇浓度合理控制甲醛生成酶 AOD 和消耗酶 DAS、FLD 的表达水平 。此前研究表明，在 C. boidinii 中，甲醇诱导初期 DAS 的诱导先于 AOD，且 DAS1 启动子活性强于 AOD1，这有助于减少过氧化物酶体中甲醛的毒性。可见，甲醇代谢酶并非同时诱导表达，而是多个甲醇诱导基因协同调控，以维持 C1 代谢平衡，避免有毒中间产物甲醛的积累。

目前，在 Komagataella phaffii、C. boidinii 和 O. polymorpha 中已鉴定出多个参与甲醇诱导基因表达的转录因子 。如 C. boidinii Trm2（CbTrm2，与 Saccharomyces cerevisiae Adr1 和 K. phaffii Mxr1 同源）参与去阻遏过程；OpMpp1 及其同源物 KpMit1、CbTrm1 及其同源物 KpTrm1，还有 CbHap 复合物等，均参与甲醇诱导过程，调控众多甲醇代谢相关基因的表达 。其中，KpMxr1 和 KpMit1 对 AOX1 和 DAS1 的 CRMI 至关重要，且 KpMit1、KpMxr1 和 KpTrm1 可结合到 AOX1 启动子的不同位点，协同调控其表达 。不过，这些 Mpp1 同源物（OpMpp1 和 KpMit1）的甲醇诱导性在生理层面的意义尚未明确。

甲基营养型酵母能够感知生长环境中的甲醇浓度，并据此调节甲醇诱导基因的表达水平 。已有研究发现，细胞表面跨膜传感器 Wsc 家族蛋白 KpWsc1 和 KpWsc3 在 K. phaffii 中负责感知甲醇浓度并参与 CRMI，KpMxr1 接收来自 KpWsc1/3 的甲醇信号，其磷酸化调控在 CRMI 中起关键作用 。但转录因子如何通过 CRMI 调控甲醇诱导基因表达的机制仍不清晰。

研究结果

1. CbMPP1 的鉴定与基因表达：通过对 C. boidinii 基因组草图的搜索，发现了假定的 Zn (II)₂Cys₆型转录因子 CbMpp1，它是 OpMpp1 和 KpMit1 的同源物。CbMpp1 由 1025 个氨基酸组成，包含与 DNA 结合的保守基序，其基因位于 C. boidinii 基因组中 DAS1 基因下游 3.4 kbp 处，与 O. polymorpha 中的基因组织相似。

利用酸性磷酸酶（APase）作为报告基因进行启动子活性分析，结果显示 CbMPP1 启动子（P_MPP1）活性在葡萄糖培养条件下完全被抑制，甘油培养条件下略有上调，甲醇培养条件下则强烈诱导。CbMPP1 的转录水平在 0.01% - 0.1% 甲醇存在时升高，在 0.1% 甲醇时达到最大值，1% 甲醇时下降，表明其表达受 CRMI 调控。

进一步研究发现，CbMPP1 的表达依赖于其他转录因子。在各种转录因子基因敲除突变体中，Cbtrm1Δ 和 Cbhap3Δ 菌株中 P_MPP1活性丧失，Cbtrm2Δ 菌株中该活性降至野生型的约 20%，Cbtrm1Δtrm2Δ 菌株中则完全丧失，而敲除 CbMPP1 不影响其启动子活性 。这说明甲醇诱导的 CbMPP1 表达完全依赖于 CbTrm1 和 CbHap 复合物，部分依赖于 CbTrm2，但不依赖于 CbMpp1 自身。

为了确定 P_MPP1中的上游激活序列（UASs），构建了携带截断 P_MPP1的 APase 表达盒单拷贝菌株，并通过 Southern blot 分析确认表达盒的单拷贝整合 。5′ 到 3′ 截断和 3′ 到 5′ 截断的 P_MPP1的 APase 报告基因活性分析表明，多个启动子区域对其功能至关重要。进一步的部分缺失分析确定了从 - 1350 到 - 1250（UAS1）和 - 1000 到 - 900（UAS2）的区域对 P_MPP1活性至关重要，且这些区域独立于 CbTrm2。将 UAS1 和 UAS2 与 CbACT1 启动子（P_ACT1）融合后，在甲醇培养条件下，其启动子活性显著增加，证明 UAS1 和 UAS2 足以赋予 P_MPP1甲醇诱导的启动子活性。
2. CbMpp1 在甲醇生长过程中的功能：对比野生型和 Cbmpp1Δ 菌株在不同碳源下的生长情况，发现 Cbmpp1Δ 菌株在甲醇培养条件下生长存在显著缺陷，而在葡萄糖、甘油、乙醇和油酸培养条件下与野生型无差异。同时，Cbmpp1Δ 菌株在甲醇培养时，AOD1、DAS1 和 FLD1 的转录水平下降，这表明 CbMpp1 对酵母利用甲醇生长以及甲醇诱导基因的表达至关重要。

染色质免疫沉淀分析显示，CbMpp1 与 AOD1、DAS1 和 FDH1 的启动子区域相互作用，但不与 CbMPP1 和 CbACT1 的启动子区域相互作用，说明 CbMpp1 正向调节 AOD1、DAS1 和 FDH1 的转录，而对自身转录水平无影响。

通过荧光显微镜观察 CbMpp1 - YFP 的亚细胞定位，发现葡萄糖培养条件下无荧光，甲醇培养条件下则定位于细胞核，证明 CbMpp1 在细胞核中发挥转录因子的作用，调控多个甲醇诱导基因的表达。
3. CbMPP1 过表达或组成型表达导致甲醇生长缺陷：为探究 CbMPP1 甲醇诱导性的生理意义，构建了过表达或组成型表达 CbMPP1 的菌株 。使用组成型激活的 CbTDH3 启动子（P_TDH3）实现 CbMPP1 的组成型表达。实验设置了对照菌株 M1（携带 P_MPP1控制下的 CbMPP1 - YFP 表达质粒）、过表达菌株 M2（除了天然 CbMPP1 基因外，还有一份 P_MPP1 - CbMPP1 - YFP 拷贝）、组成型表达菌株 T1（携带一份 P_TDH3 - CbMPP1 - YFP 表达质粒）和 T3（携带三份 P_TDH3 - CbMPP1 - YFP 表达质粒），以 Cbmpp1Δ 菌株作为转化宿主构建这些菌株。

在葡萄糖或乙醇培养基上，所有菌株生长无差异。但在甲醇培养基上，M2 菌株生长速率略低于 M1 菌株，T3 菌株生长速率低于 M1 菌株，T1 菌株则完全无法生长 。这表明 P_TDH3控制下的单拷贝 CbMPP1 表达不足以使酵母在甲醇上获得最佳生长能力，过表达（M2 菌株）或多拷贝组成型表达（T3 菌株）CbMPP1 会降低生长速率。

检测培养上清液中的甲醛浓度发现，M1 菌株在 33 h 时甲醛浓度出现短暂升高（0.4 mM），随后在继续生长过程中迅速消失；M2 菌株中甲醛的短暂升高幅度是 M1 菌株的两倍多（约 0.9 mM）；T1 菌株中未检测到甲醛，T3 菌株在长时间培养过程中积累了 0.1 mM - 0.2 mM 的甲醛，且甲醛消耗延迟 。这说明 CbMPP1 表达的异常调节会影响甲醇代谢，导致甲醛过剩或长时间积累，从而对酵母在甲醇上的生长产生缺陷。
4. CbMPP1 过表达或组成型表达影响多个甲醇诱导基因的转录水平：分析过表达或组成型表达 CbMPP1 对甲醇诱导基因转录水平的影响，发现 M2 菌株在甲醇培养条件下，CbMPP1 转录水平高于 M1 菌株，而 AOD1、DAS1 和 FLD1 的转录水平显著低于 M1 菌株，表明过表达 CbMPP1 会降低多个甲醇诱导基因的表达水平。

T1 和 T3 菌株在甲醇培养条件下，CbMPP1 转录水平低于对照菌株 M1，且 T3 菌株在各个时间点的 CbMPP1 转录水平均高于 T1 菌株，证实了 T1 和 T3 菌株中 CbMPP1 基因拷贝数依赖的组成型表达。除 T3 菌株在 1 h 时的情况外，T1 和 T3 菌株中 AOD1、DAS1 和 FLD1 的转录水平在甲醇培养条件下均低于 M1 菌株 。T3 菌株在 0 h（葡萄糖培养的细胞）时就有显著的 CbMPP1 转录水平，这可能是其在 1 h 时 AOD1、DAS1 和 FLD1 转录水平较高的原因。

对 M1、T1 和 T3 菌株进行亚细胞定位和蛋白质水平分析发现，M1 菌株中，葡萄糖培养条件下未观察到 CbMpp1 - YFP，甲醇培养条件下其定位于细胞核；而 T1 和 T3 菌株在葡萄糖和甲醇培养条件下，CbMpp1 - YFP 均定位于细胞核，表明 CbMpp1 - YFP 可在不依赖碳源的情况下定位于细胞核 。免疫印迹分析显示，T1 和 T3 菌株在葡萄糖培养条件下可检测到 CbMpp1 - YFP 蛋白，在甲醇培养过程中其含量下降，这与转录水平分析结果一致，说明 P_MPP1控制下的 CbMPP1 基因表达对于维持合适的 CbMpp1 蛋白量很有必要。此外，T1 和 T3 菌株中 AOD 和 DAS 的蛋白水平低于 M1 菌株，尤其是 T1 菌株中 DAS 蛋白水平显著较低，这可能是 T1 菌株在甲醇上生长缺陷的原因。
5. CbMPP1 的正确调节对多个甲醇诱导基因的 CRMI 至关重要：研究 CbMPP1 表达调节与 CRMI 的关系，通过定量逆转录 PCR（qRT - PCR）测量 M1、M2、T1 和 T3 菌株在不同甲醇浓度下 CbMPP1、AOD1、DAS1 和 FLD1 的转录水平，并评估其对甲醇浓度的依赖性。结果显示，在 M1 菌株中，CbMPP1、AOD1 和 DAS1 的转录水平在 0.01% - 0.1% 甲醇存在时升高，超过 0.1% 甲醇时下降；FLD1 转录水平在 0.01% - 0.1% 甲醇存在时升高，但在 1% 甲醇培养条件下未被抑制 。M2、T1 和 T3 菌株在所有甲醇浓度下，CbMPP1 转录水平均低于 M1 菌株，且这些菌株中未观察到 CbMPP1 表达的 CRMI 依赖性转录激活和抑制现象。M2、T1 和 T3 菌株中 AOD1 和 DAS1 的转录水平也低于 M1 菌株，M2 和 T3 菌株中 DAS1 的 CRMI 现象消失。这表明 P_MPP1控制下的 CbMPP1 的 CRMI 对于维持多个甲醇诱导基因的充分且适当调节至关重要，组成型或过量表达 CbMPP1 会阻碍 CRMI，说明 CbMPP1 的表达受到严格精确的调控，以维持 C. boidinii 中正常的甲醇代谢。
6. KpMIT1 的调节对 K. phaffii 中甲醇诱导基因的 CRMI 起关键作用：此前研究发现 KpMIT1 在 K. phaffii 中的表达受 CRMI 调控。此次构建了 K. phaffii 菌株 KpM1、KpM2、KpT1 和 KpT2，其中 KpM1 和 KpM2 分别携带一份和两份在 KpMIT1 启动子控制下的 KpMIT1，KpT1 和 KpT2 分别携带一份和两份在 KpTDH3 启动子控制下的 KpMIT1 。

在甲醇培养条件下，KpM1、KpM2 和 KpT2 菌株生长正常，而 KpT1 菌株生长较慢，表明 KpTDH3 启动子控制下的单拷贝 KpMIT1 表达不足以使酵母在甲醇上获得最佳生长能力 。与 C. boidinii 中的结果不同，在 K. phaffii 中过表达 KpMit1 不影响甲醇生长。

检测培养上清液中的甲醛浓度发现，KpM2 和 KpT2 菌株中的甲醛浓度高于 KpM1 菌株，但下降迅速；KpT1 菌株中甲醛消耗延迟，这可能是其生长缓慢的原因 。分析甲醇诱导基因 AOX1 和 DAS 的转录水平发现，KpM2 菌株中这两个基因的转录水平在所有甲醇浓度下均高于 KpM1 菌株，且呈现 CRMI 调节模式；KpT2 菌株中，虽然 AOX1 和 DAS 的转录水平未呈现 CRMI 调节模式，但足以支持酵母在甲醇上的最佳生长；而生长迟缓的 KpT1 菌株中，AOX1 和 DAS 的转录水平显著较低 。这表明 KpMIT1 的 CRMI 依赖性表达在甲醇诱导基因的 CRMI 中起关键作用，一定水平的 KpMit1 对于 K. phaffii 中正常的甲醇代谢是必要的。
7. AOD1 和 DAS1 的协调表达对甲醇最佳生长很重要：由于甲醇诱导基因在 C. boidinii 中的表达水平和诱导所需时间因启动子而异，推测受 CRMI 调节的 CbMPP1 表达水平决定了多个甲醇诱导基因（如 AOD1、DAS1、FLD1）转录水平的维持，以实现最佳甲醇代谢 。

为验证多个甲醇诱导基因协调调节的重要性，进行了 AOD1 和 DAS1 基因启动子交换实验。构建了三种重组菌株，DADD 菌株在 P_DAS1控制下表达 AOD1 和 DAS1，AAAD 菌株在 P_AOD1控制下表达 AOD1 和 DAS1，DAAD 菌株在 P_DAS1控制下表达 AOD1，在 P_AOD1<