基于FRET技术的布尼亚病毒"抢帽"内切酶活性检测方法开发及其抗病毒药物筛选应用

这篇研究开发了一种基于荧光共振能量转移（FRET）的高灵敏度检测方法，用于定量分析汉坦病毒RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）N端内切酶域的"抢帽"（cap-snatching）活性。该技术通过5'端6-FAM荧光标记和3'端Iowa Black淬灭剂标记的20核苷酸RNA底物，实现实时监测酶切反应（t1/2≈3分钟），信噪比达31倍。研究证实该内切酶具有RNA特异性（D97A突变体失活），为布尼亚病毒科（如汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒等）的抗病毒药物高通量筛选提供了重要工具。

　　

ABSTRACT
布尼亚病毒目包含300多种分节段负链RNA病毒，其三分体基因组（S/M/L节段）分别编码核衣壳蛋白（N蛋白）、糖蛋白前体和RNA依赖RNA聚合酶（RdRp）。RdRp作为约420 kDa的大分子蛋白，负责病毒mRNA合成和基因组复制。这类病毒通过独特的"抢帽"机制启动转录：RdRp的N端内切酶域切割宿主mRNA的5'端，利用获得的带帽片段作为引物。该内切酶域具有高度保守的α/β结构，是病毒感染的必需元件，因此成为抗病毒干预的理想靶点。本研究建立了基于FRET的体外检测体系，定量分析汉坦病毒RdRp内切酶域活性。使用5'端6-FAM/3'端Iowa Black双标记的20核苷酸RNA底物，酶切后产生显著荧光去淬灭信号，反应半衰期约3分钟，信噪比达31倍。

IMPORTANCE
布尼亚病毒目成员（如汉坦病毒、克里米亚-刚果出血热病毒等）致死率可达50%，目前尚无FDA批准的特效药。本研究开发的FRET检测法具有高效、低成本优势，适用于高通量筛选靶向内切酶的化学抑制剂，为抗病毒药物研发提供关键工具。

INTRODUCTION
布尼亚病毒、沙粒病毒和正粘病毒均采用"抢帽"机制启动转录。汉坦病毒等病原体的RdRp包含N端内切酶域、中央催化域和功能未知的C端域。X射线晶体结构显示，其内切酶域与流感病毒PA亚基具有相似的II型内切酶α/β结构及双金属离子活性中心。前期研究发现汉坦病毒偏好切割宿主mRNA第14位"G"残基，产生14核苷酸带帽引物（3'端为G），且N蛋白与RdRp C端域的相互作用对病毒复制至关重要。

RESULTS
蛋白纯化与活性验证
通过原核表达系统获得SNV病毒N蛋白（54 kDa）、RdRp内切酶域（32 kDa）及其D97A突变体。RT-qPCR检测显示，野生型内切酶域可完全降解300 nt测试RNA（与RNase A效率相当），而D97A突变体和N蛋白无活性。DPBA（锰离子螯合剂）选择性抑制内切酶活性，RNasin则特异性抑制RNase A。DNA底物实验证实该内切酶具有RNA特异性。

FRET检测体系建立
设计的FRET RNA（5'FAM-CUCCUCAUUUUUCGCUAGUU-IB3'）含第14位"G"残基。酶切后520 nm荧光强度显著升高，且发射峰无偏移。动力学分析显示，20 nM内切酶处理120 nM底物时，反应呈双曲线特征。D97A突变体及N蛋白对照组均无信号变化。

特异性与抑制剂验证
平行实验表明该体系仅响应RNA底物（ssDNA对照无信号）。DPBA处理使内切酶活性抑制率达90%以上，与金属离子依赖性机制相符。浓度梯度实验确定125 nM底物时信噪比最优（31倍）。

DISCUSSION
该FRET检测法克服了传统RT-qPCR（需多步纯化）、凝胶电泳（灵敏度低）和表面等离子共振（成本高）等技术局限。内切酶保守活性中心（His36/Asp97/Glu110）的金属离子依赖性为药物设计提供明确靶点。后续需通过384孔板筛选验证体系稳定性（z因子>0.5），以适配高通量筛选需求。

MATERIALS AND METHODS
关键实验材料包括IDT合成的FRET RNA、Sigma源DPBA抑制剂等。通过pTriEx1.1载体构建C端His标签融合蛋白，镍柱纯化后经荧光分光光度计（Shimadzu RF-5301PC）检测，参数设置：激发光465 nm（狭缝5 nm），发射光495-650 nm（狭缝10 nm）。T7转录体系制备的300 nt RNA经DNase I处理后作为酶活测试底物。