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这篇综述聚焦 661W 细胞系在视网膜疾病研究中的应用。661W 细胞系源自永生化小鼠光感受器细胞，可用于研究遗传性和获得性视网膜疾病（如视网膜色素变性 RP、年龄相关性黄斑变性 AMD）的发病机制、探索分子标记和评估治疗干预，虽有局限但价值重大。
引言
视网膜疾病是全球范围内导致视力障碍和失明的重要原因，包括遗传性和获得性两种类型，它们会引起光感受器的进行性退化。目前针对视网膜疾病的治疗手段有限，如仅 Luxturna? 被批准用于治疗一小部分 RPE65 基因突变的患者，这凸显了进一步开发治疗方法的迫切性。在研究视网膜疾病时，体外细胞模型发挥着重要作用，而 661W 细胞系作为一种独特的工具，在视网膜疾病研究中展现出了巨大的价值。
661W 细胞系的历史与特征
1992 年，Al - Ubaidi 等人在研究病毒癌基因在光感受器中的表达时，利用视黄醛结合蛋白（IRBP）启动子驱动猿猴病毒 40（SV40）大 T 抗原的表达，导致转基因小鼠出现早期双侧视网膜和脑肿瘤。随后，从这些视网膜肿瘤中分离出了 661W 细胞系。直到 2004 年，该细胞系才被 Al - Ubaidi 团队全面表征。在培养过程中，661W 细胞会贴壁生长，起初细胞质和细胞核大小相当，附着后细胞质增大，细胞呈细长纺锤形，会形成单层并倾向于聚集，便于细胞间接触。其增殖迅速，在添加牛血清的 DMEM 培养基中，细胞倍增时间约为 24 小时，表皮生长因子（EGF）或成纤维细胞生长因子（FGF）等生长因子可促进其增殖。从生理特征和基因表达模式来看，661W 细胞更类似于视锥光感受器，它表达视锥蛋白、转导蛋白和抑制蛋白等参与视锥光转导级联的蛋白质，但不表达视紫红质或视杆抑制蛋白。此外，661W 细胞缺乏光感受器典型的外段结构，形态上不能代表光感受器。不过，光照可使 661W 细胞的环磷酸鸟苷（cGMP）等信号通路发生变化，虽然它对不同波长光的反应与天然光感受器不同，但研究人员利用这一特性研究了光照对细胞过程的影响，如基因表达、蛋白质磷酸化和细胞存活等。近年来，研究发现 661W 细胞表达许多与纤毛相关的基因，存在明显的纤毛结构及相关蛋白，使其成为研究视网膜纤毛病中视锥光感受器退化的合适模型。
体外研究视网膜疾病的模型
在研究视网膜疾病的体外模型中，除了 661W 细胞系，还有其他多种细胞系。例如，视网膜母细胞瘤 Y - 79 和 WERI - Rb 细胞系、MU - PH1 细胞系等都与光感受器有一定相似性，但它们各自存在局限性。Y - 79 细胞系虽表达视杆和视锥光感受器基因，但更常用于视网膜母细胞瘤研究；WERI - Rb 细胞系仅在甲状腺激素处理时表达 L 和 M 视蛋白基因，限制了其在光感受器研究中的应用；MU - PH1 细胞系具有祖细胞特征，目前相关研究较少。相比之下，661W 细胞系是目前研究最深入的永生化光感受器细胞模型。视网膜色素上皮（RPE）细胞的退化也是视网膜疾病的重要方面，如在年龄相关性黄斑变性（AMD）中。ARPE - 19 细胞系是研究 RPE 退化最常用的模型，可与 661W 细胞系并行研究，模拟 AMD 患者中 RPE 和光感受器的退化。在研究视神经病变时，曾使用 RGC - 5 细胞系模拟视网膜神经节细胞（RGCs），但后来发现该细胞系不能准确代表 RGCs，相关研究已被撤回。此外，MIO - M1 细胞系可作为 Müller 胶质细胞的模型，MG5 细胞系可用于模拟小胶质细胞。原代视网膜培养是研究视网膜功能和退化最具生理相关性的细胞模型，它保留了关键的结构和功能特性，但培养时需要额外的补充剂、神经营养因子和底物，成本较高，且分离的光感受器细胞在培养过程中容易失去内外段，寿命较短。视网膜类器官是由人多能干细胞（hPSCs）衍生而来的类似视网膜的组织，能模拟人类视网膜的细胞结构和分子功能，但存在成本高、难以维持和分化过程复杂耗时等问题，不过对于患者定制的干预研究具有重要价值。综合来看，661W 细胞系作为永生化细胞系，为视网膜疾病的初步研究提供了有价值的替代方案。
661W 细胞系在遗传性视网膜疾病研究中的应用
全色盲
全色盲是一种视锥营养不良疾病，主要由视锥光转导相关基因突变引起，导致视锥光感受器功能障碍或退化，全球发病率约为 1:30,000，目前尚无有效治疗方法。常见的致病基因是环核苷酸门控通道（CNGA3 和 CNGB3）基因的突变，在不同人群中，这两种基因突变的比例有所差异。目前针对 CNGA3 和 CNGB3 基因的病毒基因治疗临床试验虽有一定效果，但仍需进一步改进。661W 细胞系作为视锥样细胞系，为快速跟踪基因治疗的安全性和转染效率测试提供了理想模型。不过，661W 细胞本身不表达内源性 CNGA3，仅少量表达 CNGB3，需要外源表达这些基因进行相关研究。研究发现，表达不同人类 CNGA3 和 CNGB3 突变的 661W 细胞，其细胞毒性与细胞内钙（Ca2+）和环磷酸鸟苷（cGMP）增加以及未折叠蛋白反应（UPR）标记物增加有关。此外，阻断 CNG 通道或去除细胞外 Ca2+可挽救 661W 细胞的活力，表明高细胞内 Ca2+是 CNG 相关视锥细胞退化的主要原因。对于其他全色盲相关疾病基因，如 GNAT2、PDE6C、PDE6H 和 ATF6 等，虽然它们在全球范围内导致的全色盲病例较少，但在某些特定人群中发病率较高，661W 细胞系有望成为研究这些基因的理想模型。
视网膜色素变性（RP）
视网膜色素变性是一种常见的遗传性视网膜疾病，属于视杆 - 视锥营养不良，全球发病率约为 1:4000，其致病突变通常发生在视杆特异性基因，导致视杆细胞首先死亡，随后视锥细胞发生继发性退化。患者最初表现为夜盲症，随着病情进展，视野逐渐缩小，最终可能完全失明。在视网膜色素变性中，氧化应激是导致光感受器损伤和死亡的重要因素。在 661W 细胞中，常通过过氧化氢（H2O2）处理和光损伤等方法诱导氧化应激，以研究潜在的治疗靶点和神经保护疗法。例如，抑制神经酰胺（CER）合成或增加鞘氨醇 - 1 - 磷酸（S1P）活性可减少细胞死亡；抑制丙酮酸激酶 2（PKM2）可减轻光损伤引起的细胞死亡和氧化应激；组蛋白去乙酰化酶（HDAC）抑制剂也被证明对保护 661W 细胞免受氧化应激有一定作用。除了氧化应激，Ca2+水平升高也是视网膜色素变性的一个重要特征。在 661W 细胞中，研究人员通过使用钙离子载体 A23187 等方法增加细胞内 Ca2+水平，评估了多种药物的神经保护作用。如辛二酰苯胺异羟肟酸（SAHA）、胰岛素样生长因子 - 1（IGF - 1）和二甲双胍等药物都能部分恢复 Ca2+过载条件下 661W 细胞的活力。此外，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路在视网膜色素变性中也起着关键作用，研究发现核糖体 S6 激酶 1（S6K1）对 661W 细胞的存活至关重要，二甲双胍作为 mTORC1 的抑制剂，在 661W 细胞实验和动物模型中都显示出对 Ca2+诱导的细胞凋亡有保护作用。为了更好地研究视网膜色素变性中视杆细胞的退化，研究人员对 661W 细胞进行了一些改造。例如，Liu 等人在 661W 细胞中过表达视紫红质（RHO），研究了常染色体显性 RHO 突变对光感受器能量代谢的影响；Huang 等人开发了 661W - A11 细胞系，该细胞系表达视杆特异性基因，更能代表体外的视杆细胞，通过抑制磷酸二酯酶 6（PDE6）活性，可模拟视网膜色素变性视杆细胞的病理生理过程。
莱伯先天性黑蒙（LCA）
莱伯先天性黑蒙是一种罕见的严重早期发作的视网膜疾病，与视网膜色素变性有相似的临床特征，出生或婴儿早期就会出现症状。已发现超过 20 种与该疾病相关的基因，其中 RPE65 基因是最著名的 LCA 相关基因，FDA 批准的 Luxturna? 基因疗法就是针对该基因的突变。Tang 等人在 661W 细胞中发现，外源表达 RPE65 可促进光色素再生，支持视锥细胞功能，这为理解 Luxturna? 的治疗效果提供了重要信息。此外，在研究 CCT2 基因突变时，661W 细胞也发挥了重要作用。研究人员发现，在 661W 细胞中敲低 CCT2 基因会导致细胞增殖减少，而过表达野生型 CCT2 可显著挽救细胞增殖，突变型则无此效果。相比视网膜类器官，661W 细胞更易于使用和维护，便于研究基因突变的功能。
尤塞氏综合征
尤塞氏综合征是一种罕见的纤毛病，患者除了有视网膜变性的症状外，还伴有感音神经性听力损失。目前已确定 15 种与该疾病相关的基因，但动物模型在模拟视网膜变性方面存在不足。虽然 661W 细胞已被证实是研究纤毛病的合适模型，但在尤塞氏综合征研究中的应用还较少。有研究成功将尤塞氏综合征致病突变引入 661W 细胞的 CLRN1 基因，并证明可通过反义寡核苷酸方法纠正该突变，未来在这方面还有很大的研究空间。
巴德 - 比德尔综合征
巴德 - 比德尔综合征是一种罕见的纤毛病，具有多种严重症状，包括认知障碍、肾功能障碍、肥胖、心脏缺陷以及视杆 - 视锥营养不良等。视网膜变性通常在患者 7 - 8 岁时开始显现，许多患者在青少年时期就会失明。虽然已确定 24 种相关疾病基因，但仍有 20 - 30% 的患者病因不明。Zhang 等人在 661W 细胞中的研究发现，成熟的 microRNA miR - 183 对视力至关重要，其缺失会导致巴德 - 比德尔综合征（BBS）基因下调。过表达 Rnf217 蛋白（miR - 183 的直接靶点）可进一步证实 BBS 基因的下调。这为使用 661W 细胞进一步研究巴德 - 比德尔综合征的视网膜变性提供了方向，也为患者的基因筛查提供了潜在的研究靶点。
661W 细胞系在获得性视网膜疾病研究中的应用
年龄相关性黄斑变性（AMD）
年龄相关性黄斑变性是一种进行性视网膜疾病，主要影响视网膜中央的黄斑区域，导致视锥光感受器丧失，严重影响视力。该疾病分为新生血管性和地图样萎缩性两种类型，目前针对新生血管性 AMD 有抗 VEGF 注射和激光治疗等方法，但地图样萎缩性 AMD 尚无有效治疗手段。在 AMD 研究中，661W 细胞系被广泛用于研究视锥细胞退化的分子机制。与视网膜色素变性类似，氧化应激在 AMD 中也起着重要作用。研究发现，全反式视黄醛（atRAL）积累与地图样萎缩性 AMD 密切相关，atRAL 积累会损害内质网（ER）功能，导致真核翻译起始因子 2α（eIF2α）激活，通过 c - Jun N 末端激酶（JNK）信号通路依赖的细胞凋亡和 gasdermin E（GSDME）介导的焦亡促进视网膜变性。在 atRAL 加载的 661W 细胞中，一些具有抗氧化和抗炎特性的物质，如藏红花素，可改善细胞活力，减轻氧化应激和线粒体损伤，减少细胞凋亡、焦亡和铁死亡。此外，研究还发现，在 AMD 中，内源性二氧化硫（SO2）/ 天冬氨酸转氨酶 1（AAT1）通路、ERK1/2 和 STAT3 信号通路等都与氧化应激和细胞凋亡密切相关，661W 细胞为研究这些通路提供了重要模型。炎症也是 AMD 的一个重要致病因素。在 661W 细胞中的研究表明，AMD 中的炎症涉及补体系统、血管内皮生长因子（VEGF）和促炎信号通路等多个因素。例如，补体系统中的 C5b - 9 可使 661W 细胞对某些凋亡和坏死性凋亡途径敏感；VEGF 治疗可诱导 661W 细胞表达炎症蛋白，而黄酮类化合物槲皮素可抑制炎症分子表达，抑制血管生成反应，并通过抑制 MAPK 和 AKT 磷酸化使 NF - κB 通路失活。此外，一些药物如 AICAR 等也被发现可通过调节炎症反应，对 661W 细胞起到保护作用。由于 AMD 是一种多因素疾病，RPE 细胞的退化也是其重要特征。为了更好地模拟 AMD 的病理过程，研究人员采用了双细胞模型方法，即同时使用 ARPE - 19 细胞系和 661W 细胞系。通过对两种细胞系进行铁离子过载处理，构建慢性损伤模型，发现这种模型可导致细胞出现衰老样变化、增殖受损、线粒体功能障碍和细胞凋亡，并且在小鼠体内可诱导出类似地图样萎缩性 AMD 的病变，降低视觉功能。这种双细胞模型为研究 AMD 的发病机制提供了更全面的视角，有助于开发更有效的治疗方法。
糖尿病性视网膜病变
糖尿病性视网膜病变是糖尿病患者由于高血糖导致的视网膜血管萎缩性疾病，会引起血管渗漏，影响患者视力。其治疗方法与新生血管性 AMD 相似，但目前在细胞模型研究向临床转化方面存在问题，因为细胞模型无法完全模拟疾病中异常的血管生成。在 661W 细胞中，研究人员对高血糖以及多种治疗方法进行了研究。蛋白质组学分析发现，高血糖条件下 661W 细胞的凋亡和活性氧（ROS）增加，细胞依赖自噬来抵消这些影响。一些药物如生长抑素和萝卜硫素在高血糖条件下对 661W 细胞有一定的保护作用，但效果并不显著。此外，研究人员还通过向 661W 细胞中添加晚期糖基化终产物（AGEs）来模拟糖尿病性视网膜病变条件，但这种方法是否能完全代表疾病的复杂性还有待进一步研究。总体而言，糖尿病性视网膜病变的病理生理机制较为复杂，在 661W 细胞中难以完全重现。
青光眼
青光眼是一种多因素导致的视神经病变，全球约有 8000 万人受其影响，最终会导致进行性视力丧失。以往研究青光眼常用 RGC - 5 细胞系，但后来发现该细胞系不能准确代表 RGCs。有研究尝试将 661W 细胞用星形孢菌素处理，使其分化为视网膜神经节前体样细胞，但这种分化后的细胞能否代表 RGCs 仍存在争议，目前也没有其他更合适的增殖性细胞模型用于研究青光眼。青光眼通常被认为是一种获得性疾病，可在 661W 细胞中通过压力室升高压力来模拟获得性青光眼。研究发现，大麻素对压力诱导的 661W 细胞毒性有保护作用，在大鼠青光眼模型中也验证了大麻酚的治疗效果。此外，大麻素对光诱导应激的 661W 细胞也有保护作用。虽然大麻酚在人类青光眼患者中的眼压降低效果尚未评估，但其他大麻素如 Δ9 - 四氢大麻酚（THC）和大麻二酚（CBD）在临床试验中显示出可降低眼压，但治疗效果仅持续数小时。由于大麻素种类繁多，661W 细胞可作为筛选潜在大麻素类青光眼治疗药物的重要工具。在青光眼的遗传研究方面，研究人员在 661W 细胞中对与早发性青光眼相关的 MYOC 和 OPTN 基因进行了研究。诱导 MYOC 基因的表达发现，突变型 MYOC 细胞的自噬活性降低，线粒体功能障碍和氧化应激增加；在分化的 661W 细胞中诱导 OPTN 基因表达，发现突变型 OPTN 会降低细胞活力。而 Acteoside 作为一种神经保护药物，可挽救 OPTN 过表达诱导的 661W 细胞死亡，在青光眼动物模型中也显示出一定的治疗潜力，但在慢性遗传性青光眼中的效果还需进一步研究。
661W 细胞系在 AAV 筛选中的应用
腺相关病毒（AAV）因其安全性高、能有效转导视网膜细胞并驱动长期基因表达，在视力研究的基因治疗中被广泛应用。661W 细胞系成为测试 AAV 的重要模型，多项研究利用其评估 AAV 血清型的嗜性和转导效率。Ryals 等人筛选了多种自互补 AAV（scAAV），发现 scAAV1 和 scAAV2 在 661W 和 ARPE - 19 细胞中的转导效率高于 scAAV5 和 scAAV8，并且增加 Y - F 衣壳突变数量可提高转导效率。Kay 等人进一步筛选多种衣壳突变的 AAV 载体，发现 scAAV2（quadY - F + T<
