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这篇综述聚焦头颈部癌患者来源类器官（PDOs），详细介绍其构建技术，如共培养、气液界面等方法，阐述在肿瘤机制研究、药物筛选、个性化医疗等方面的应用，探讨现存问题，为该领域研究提供全面参考。
头颈部癌患者来源类器官的技术与应用：系统综述
一、引言
头颈部癌（HNC）涵盖喉、下咽、鼻咽、口腔、咽喉、甲状腺和唾液腺等部位的癌症，头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是全球第六大常见癌症 。其发病率和预后受烟草、酒精、人乳头瘤病毒（HPV）及社会经济因素等影响，唾液腺肿瘤和甲状腺肿瘤也是头颈部肿瘤的重要组成部分。严重的 HNC 会影响头颈部器官功能和外观，临床常见治疗方案是手术，术后辅以放疗、化疗等 。近年来，靶向治疗和免疫治疗的发展为 HNC 患者新辅助治疗提供更多选择，但相同治疗方案在不同患者中疗效差异显著，这与 HNC 的肿瘤异质性密切相关。因此，寻找合适的临床前模型预测和评估患者对不同治疗方案的反应，对提高治疗有效率、减少副作用至关重要。传统二维癌细胞系虽广泛用于药物筛选，但无法真实预测临床反应，限制其发展。以患者来源类器官（PDOs）为代表的新型三维模型构建起相对完整的研究体系，应用前景广阔。本文系统阐述头颈部癌 PDOs 的技术与应用。
二、研究方法
以 “head and neck, cancer or tumor, organoid or organoids” 中英文检索词，在 CNKI、万方数据库和 PubMed 中检索 2023 年 11 月前发表的相关文章。最初筛选出 167 篇，经排除标准剔除 119 篇，纳入 48 篇。进一步阅读重要参考文献，又纳入 20 篇非重复文章，最终共纳入 68 篇文章，涵盖头颈部癌临床前模型优缺点介绍与比较、PDOs 技术及应用等主题。
三、研究结果
- HNC 临床前研究模型
- 二维癌细胞系：二维癌细胞系是研究头颈部肿瘤发生机制和药物敏感性的传统体外模型，具有易建立操作、涵盖多种肿瘤亚型、成本低和可重复性强等优点 。如 ATCC 细胞库中引用率最高的五种 HNSCC 细胞系包括 FaDu、CAL 27 等。但随着研究深入，其缺点逐渐暴露，无法复制肿瘤空间结构和模拟细胞与基质间相互作用，导致临床前药物敏感性结果与人体实际结果差异大 。此外，其构建耗时久、永生化成功率低，传代后还可能出现遗传物质改变和细胞污染等问题，限制了二维癌细胞系的发展应用。
- 新型三维模型：
- 球体模型：球体是最简单的三维模型，由单细胞培养或组织片段形成细胞聚集体，可根据细胞来源分类 。多细胞肿瘤球体（MCTS）通常由单一癌细胞系或处理后的肿瘤组织培养而成，构建容易、成本低，还能富集癌症干细胞 。不过，MCTS 结构简单，缺乏肿瘤微环境以及免疫细胞与肿瘤细胞间的相互作用，难以真实模拟体内肿瘤情况。
- 患者来源异种移植模型（PDX）：PDX 模型通过将患者来源的肿瘤组织或原代培养细胞植入免疫缺陷小鼠构建而成，在组织病理学、分子生物学和基因水平保留了原发性肿瘤的大部分特征 ，对临床疗效的预测能力优于球体模型，广泛应用于新药研发、生物标志物鉴定和肿瘤异质性研究等方面 。然而，PDX 模型培养周期长（平均 2 - 4 个月）、成本高、成功率低，对技术人员和实验室条件要求高，不利于个性化医疗 。且多次传代后，其遗传物质与原发性肿瘤的相似度显著降低，可能影响研究结果，尤其是药物筛选结果。
- 患者来源类器官（PDOs）：PDOs 是基于类器官技术的新型体外三维肿瘤模型 。多数头颈部癌 PDOs 构建步骤相似，先将手术切除的肿瘤组织切碎，去除非上皮组织，再用物理或酶解法将其解离成单细胞悬液，与基质胶（Matrigel）和多种生长因子混合培养 。Kuan 等通过体外扩增 HNC 患者血液中的循环肿瘤细胞建立类器官模型，并成功用于药物敏感性分析 。PDOs 培养周期短（平均 7 - 14 天）、成本低，已成功构建多种肿瘤类器官模型，能有效复制原发性肿瘤的遗传特征，三维结构比传统二维癌细胞系更接近体内肿瘤真实情况 。但随着 PDO 培养技术发展，其传统模型存在的成功率低、缺乏免疫细胞和基质细胞成分等问题逐渐得到解决。不过，Choi 等报道 HNC PDOs 多次传代后会发生克隆进化，后期传代中部分等位基因丢失，因此需进一步研究确保 PDOs 与原发性肿瘤遗传特征相似。
- PDX 来源类器官（PDXO）：PDXOs 是与 PDOs 类似的新型临床前模型，利用已成功构建的 PDX 中的肿瘤细胞，在类似 PDO 的环境中培养 。目前 PDXOs 使用较少，常作为 PDOs 的补充替代。例如，唾液腺 PDOs 增殖缓慢、构建率低，传代扩增获得的细胞数量有限，无法满足多项研究需求，此时 PDXOs 可补充细胞数量 。但 PDXOs 培养中可能混入小鼠间充质细胞，使用前需评估小鼠细胞比例及其对研究结果的潜在影响。
- 患者来源头颈部癌类器官的技术
- 共培养：传统肿瘤类器官模型常缺乏免疫细胞和基质细胞成分，难以准确模拟肿瘤微环境（TME） 。共培养技术通过引入外周血免疫细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）等额外成分，构建更全面的 TME，模拟肿瘤免疫调节功能，助力免疫治疗途径和药物研究 。Neal 等将患者来源的原发性肿瘤上皮细胞与肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）共培养，成功构建包含 T 细胞、B 细胞、NK 细胞和巨噬细胞等固有免疫细胞的 PDOs 模型，并证明该模型可模拟免疫检查点阻断反应 。Dijkstra 等利用共培养技术成功扩增对肿瘤组织特异性反应的自体肿瘤反应性 CD8+ T 细胞产物，表明可在体外快速生成患者特异性 T 细胞产物，如过继性 T 细胞 。此外，研究发现部分上皮 - 间质转化（p - EMT）过程与 HNSCC 肿瘤细胞多样性相关 。Luo 等构建了结直肠癌 PDO - CAFs 共培养模型评估药物疗效 。Zhao 等证实肿瘤细胞与 CAFs 的相互作用可促进肿瘤生长、复发和转移，还发现沉默 CAFs 中的 N - 甲基转移酶（NNMT）基因可降低肿瘤活性，进一步揭示了 CAFs 与肿瘤细胞在肿瘤发生发展中的相互作用。
- 气液界面（ALI）：气液界面是共培养技术的基础，二者常结合构建更完整的 TME 。ALI 技术在基于胶原的气液界面培养系统中同时引入上皮和间质 / 基质成分构建三维类器官模型 。传统类器官培养需添加多种生长因子，而 ALI 技术下，添加间质 / 基质成分后，PDOs 无需额外添加外源性生长因子即可生长 。ALI 技术构建的 PDOs 含有多种免疫细胞，如 CD8+ T 细胞、NK 细胞、巨噬细胞等，其中 CD8+ T 细胞的持续存在表明该 PDOs 可用于针对 PD - 1/PD - L1 轴的免疫检查点抑制剂（ICI）治疗 。其他潜在适用的免疫治疗方案包括过继性 T 细胞疗法（ACT），如 CAR - T 细胞疗法、TIL 疗法、TCR - T 疗法等 。ALI 技术已在肾癌、囊性纤维化等疾病模型中广泛应用，但在 HNC 中的应用有待进一步开发。
- 微流控装置：微流控装置又称微流控芯片，是利用微纳尺度管道处理或操控流体的系统，其内部流体具有层流和液滴等特殊性质 。通过微流控技术精确控制层流或液滴混合效果，可实现传统方法难以完成的微加工和微操作 。传统 PDOs 培养在基质胶中解离肿瘤细胞，易导致同批类器官模型因细胞分布不均而存在差异 。Zhang 等利用微流控装置使培养皿各部分由 1500 个直径 500μm 的肿瘤细胞液滴和基质胶液滴组成，提高了类器官模型构建的成功率和纯度 。Bohrer 等利用 Zephyr 微流控平台向诱导多能干细胞（iPSC）培养系统中添加基因编辑试剂，校正致病突变基因，并开发出适合移植的视网膜类器官组织 。微流控装置的发展为新型三维模型构建奠定基础，Wang 等利用乳化微流控技术从患者肿瘤组织和 PDOs 开发出微器官球（MOSs）模型，能有效模拟肿瘤遗传特征和药物反应，具有体积小、自动化程度高、可用于高通量药物筛选等优势 。此外，微流控芯片系统还可实现组织体外血管化，已成功用于活类器官组织的培养和移植 。目前微流控装置在 HNC PDOs 中的应用较少，LUGO 等开发了包含 HNC 患者肿瘤淋巴管和肿瘤来源成纤维细胞（TDF）的微流控器官模型，研究发现 TDF 可诱导淋巴管生长、改变血管通透性并增加促淋巴管生成基因如 IGF - 1 的表达，有助于剖析 HNC 的转移机制和预后。
- 类器官芯片：类器官芯片是下一代高通量、高仿生的体外模型构建平台，集成了类器官分选、培养、观察、诱导、检测和分析等一系列实验过程 ，已在结直肠癌、小肠癌、多囊肾病等领域应用 。微流控装置是类器官微阵列的重要组成部分，可预设类器官模型培养环境的生化信号、机械力、营养供应等方面，构建不同 PDOs 用于药物筛选试验或机制研究 。但人体是多器官协同的整体，单个类器官芯片无法完全模拟体内情况，因此需开发多器官类器官芯片模拟体内器官间的协同效应 。Yin 等设计了包含肝脏类器官和心脏类器官的多器官类器官芯片评估药物安全性，发现抗抑郁药氯米帕明经肝脏代谢后，心脏器官的细胞活力显著下降 。目前 HNC 类器官芯片报道较少，但 Wang 等开发了可快速生成 HNC 类器官的微阵列 。考虑到头颈部肿瘤易转移至颈部淋巴结或肺部等远处器官，构建用于研究 HNC 转移机制或化疗药物副作用的多器官类器官芯片可能是未来研究方向之一。
- 组装体：已构建的 PDOs 虽能使 iPSC 分化为特定器官细胞类型并再现相应器官部分功能，但仍存在局限性，如无法模拟成熟器官结构，缺乏 TME 和细胞间关键相互作用 。Kim 等率先利用 3D 打印技术将组织基质和肌肉成分融入膀胱类器官，成功构建可生长 200 天的膀胱组装体 。随后，他们利用患者来源的膀胱癌类器官、患者匹配的内皮细胞（HULEC）和 CAFs 构建了膀胱癌组装体 。近年来，组装体逐渐应用于神经系统发育和体外神经通路构建研究。Miura 等利用人类多能干细胞成功构建脑组装体，可模拟人类大脑早期发育阶段，用于研究遗传或环境相关脑部疾病的发病机制 。与 PDOs 相比，组装体可更准确模拟多种复杂难治性疾病，有助于开发更好的治疗方案，为多种疾病的精准个性化治疗提供新方向。
- 患者来源头颈部癌类器官的应用
- 肿瘤形成、进展和转移机制研究：PDOs 作为下一代体外模型，与相应肿瘤组织具有相似的细胞类型和空间结构，多种肿瘤类器官模型已被建立 。Tanaka 首次报道构建 HNC PDOs 模型，验证其与原发肿瘤在组织学特征、上皮和间质标记物方面相似，对药物治疗反应一致 。此后，学者不断改进 HNC PDOs 培养方案，扩大样本库至唾液腺肿瘤和甲状腺癌等 。Millen、SHRIVASTAVA 等在构建的 HNC PDOs 中发现 TP53、NOTCH1、PIK3CA 和 CDKN2A 等一系列癌症相关基因高频突变 。Willem 等发现 HNC 类器官中 RANKL mRNA 表达比正常类器官高 20 - 43 倍，但相应蛋白水平与 mRNA 表达水平无直接关联 。为研究不同突变基因在肿瘤发展、进展和转移过程中的作用，可利用 CRISPR - Cas9 基因编辑技术 。一方面，敲除 PDOs 中已鉴定的突变基因确定其作用，如 Zhou 等发现敲除 PDOs 模型中的 DUSP4 基因可显著减缓细胞增殖速率和抑制生长 。Khalil 等发现敲低 NR2F1 基因也可抑制生长，提示核受体 NR2F1 激动剂可能是预防肿瘤转移的治疗策略 。另一方面，将癌症相关基因导入正常类器官模型构建癌症模型，如 Matano 等将多个直肠癌相关突变基因导入正常人肠上皮类器官模型，植入小鼠肾包膜下成功形成肿瘤 。PDOs 与 CRISPR - Cas9 基因编辑技术结合，可精准定位各类肿瘤中的致癌基因，为未来治疗靶点的确定提供有效方向。
- 肿瘤异质性研究和患者个体治疗反应预测：HSNCC 的标准非手术治疗方案是基于标准剂量顺铂的同步放化疗（CRT），但仍有大量患者在标准化治疗后 2 年内复发和 / 或转移 。西妥昔单抗是中国自 2020 年批准用于治疗 HNC 的唯一抗 EGFR 抗体，多项研究表明其与放疗联合未显著改善患者长期生存 。同一治疗方案在患者中疗效差异与肿瘤异质性密切相关，肿瘤异质性包括 “肿瘤间异质性” 和 “肿瘤内异质性” 。Mroz 等开发突变等位基因肿瘤异质性（MATH）评分量化肿瘤遗传异质性，研究发现 HNC 中较高的 MATH 评分和肿瘤内异质性与较差的总生存期相关 。鉴于 HNC 的高肿瘤异质性，准确判断患者预后困难
