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本文建立了一种新型泛真菌筛选平台用于抗真菌药物发现（原理验证研究）。通过优化培养基（fRPMI）等条件，对多种真菌病原体进行筛选。该平台简单、可适应且适合高通量筛选，有望加速抗真菌药物研发进程。
### 引言
真菌疾病治疗面临诸多挑战，现有抗真菌药物存在毒性、耐药性等问题，且自 2001 年以来无新类别药物用于临床。近年来虽有新药物处于临床试验后期，但研发仍需突破。
片段化药物发现（FBDD）是一种强大的新药研发方法，不过针对抗真菌化合物的 FBDD 研究较少。传统药敏试验条件限制了高通量筛选，部分真菌在标准条件下生长不佳。因此，研究旨在开发一种标准化泛真菌筛选平台，用于抗真菌药物发现。
结果
- 测定优化和药敏试验：为实现高质量的化合物筛选测定，需优化多种真菌的生长条件。选择 6 种酵母和 6 种霉菌，在真菌 RPMI（fRPMI）和 RPMI 2% G - 3 -（N - 吗啉代）丙烷磺酸（MOPS）中培养 48 小时，优化温度、时间、孵育条件等变量。
通过动力学生长曲线确定酵母和霉菌的最佳测量时间点（Ta）。酵母在 fRPMI 中的Ta一般在 10 - 26 小时，在 RPMI 2% G - MOPS 中为 18 - 24 小时；霉菌在 fRPMI 中的Ta为 17 - 21 小时，在 RPMI 2% G - MOPS 中为 19 - 32 小时 。
fRPMI 能显著促进部分真菌生长，如C. albicans、C. tropicalis和C. parapsilosis在 fRPMI 中 24 小时后的生长明显优于 RPMI 2% G - MOPS；A. fumigatus、A. terreus、R. microsporus和L. corymbifera在 fRPMI 中的生长在 24 和 / 或 48 小时后也显著改善。最终选择优化后的A. fumigatus、C. albicans、C. auris、N. glabratus和C. neoformans测定方法进行高通量筛选，并以两性霉素 B 或伏立康唑作为阳性对照。
- z - 因子表明测定质量高：计算 z - 因子评估测定质量，所有生物体的测定均达到高质量（≥0.5）。A. fumigatus和C. neoformans的测定得分较低，是由于生长较差或光密度变异性较大。
- z - 分数分析确定化合物命中：选择 z - 分数阈值≤ - 1.96 表示有 95% 置信度的生长抑制，≤ - 2.58 表示 99% 置信度。C. neoformans在 1 mM 浓度筛选时出现大量命中结果，导致数据偏差，因此未对其他生物体使用该浓度筛选。
N. glabratus筛选产生的显著命中化合物最多，部分化合物具有多物种活性。同时，鉴定出一些泛测定干扰（PAINs）和有毒化合物，如含有异噻唑啉化学基团的化合物、达唑霉和二甲菌核利等。
讨论
本研究建立了一种有前景的泛真菌药物发现表型方法，通过 z - 因子分析证明测定质量高且敏感，可快速标准化多真菌物种的药物发现早期阶段。
与传统单物种筛选相比，多物种筛选方法可能提高识别具有泛真菌相关性的新药物靶点的机会。虽然表型筛选无法确定靶点，但可通过结构活性关系研究和靶点识别方法进一步探索。
fRPMI 培养基相比其他培养基具有优势，但加速生长可能导致丝状真菌在液 - 气界面形成菌丝聚集体。光学密度生长测定法不适用于评估化合物对菌丝生长和生物膜等形态的活性，可使用代谢报告物或结晶紫测定法进行补充。
研究存在一定局限性，如使用的菌株可能无法完全代表各物种，偏向酵母物种，丝状霉菌种类较少。未来研究可纳入更多真菌物种，开展组合用药、化学片段研究等。
材料和方法
- 真菌分离株和培养：使用临床、环境和实验室菌株作为代表性真菌病原体。霉菌在萨布罗右旋糖琼脂上 37°C 培养 48 - 72 小时，收获分生孢子；酵母在 YPD 琼脂上 30°C 培养 48 小时，经过夜培养后离心重悬计数。
- 培养基条件和测定优化：fRPMI 培养基包含多种成分，用于增强真菌生长。将 12 种真菌病原体在 fRPMI 和 RPMI 2% G - MOPS 中培养，通过 Tecan Spark 酶标仪测定动力学生长曲线，记录 OD600（霉菌）或 OD530（酵母）读数。
- 抗真菌药敏试验：选择伏立康唑或两性霉素 B 作为阳性对照，使用肉汤微量稀释法根据 EUCAST 指南测定最低抑菌浓度（MIC），在 fRPMI 和 RPMI 2% G - MOPS 中进行，实验重复多次。
- Maybridge Ro3 片段库：从 Maybridge Ro3 片段库购买 500 种化合物，溶解于 DMSO 并储存。
- 化合物库筛选：将化合物稀释至 0.1 mM 和 1 mM，加入 96 孔板，设置正负对照，加入真菌接种物后 37°C 孵育，在最佳时间点读取 OD 值。
- 数据分析：计算 z - 因子评估测定质量，计算 z - 分数表示数据点与数据集均值的标准差数量，同时记录生长抑制百分比。
